肺炎支原體的實驗室檢測技術(shù)研究進展

周立中

濱州市人民醫(yī)院 山東 濱州 256610

肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，Mp)是一種介于細菌與病毒之間﹑在有氧或無氧環(huán)境中均能獨立存活的最小病原微生物，主要通過呼吸道飛沫或氣溶膠傳播，是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體之一[1]。Mp感染早期臨床癥狀與其他細菌和病毒感染肺炎無明顯區(qū)別，多見劇烈咳嗽﹑發(fā)熱(常為稽留熱)﹑畏寒﹑頭痛和咽痛[2-3]，且對作用一般細菌細胞壁的抗生素，如青霉素﹑頭孢菌素等不敏感，必須需選用抑制蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類﹑氟喹諾酮類﹑四環(huán)素類抗生素進行治療。因此，Mp的早期實驗室檢測對合理選用抗生素治療具有重要意義。目前Mp實驗室檢測方法主要有分離培養(yǎng)﹑抗原檢測﹑抗體檢測和基因診斷技術(shù)檢測等。

1 分離培養(yǎng)

Mp分離培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的檢測手段，是判斷Mp感染的“金標(biāo)準”。Mp分離培養(yǎng)常以牛心消化液為基礎(chǔ)另加20小牛血清及新鮮酵母浸液制成液體或固體培養(yǎng)基，初次分離需要孵育7～15d，待培養(yǎng)基指示劑由粉紅色變黃色后，及時轉(zhuǎn)種于固體平板培養(yǎng)基，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)1～2周可長出菌落直徑小于0.5mm的荷包蛋樣菌落，以此可初步診斷，再進一步進行生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定。Kashyap等[4]認為采用咽拭子或痰液標(biāo)本進行Mp分離培養(yǎng)是目前檢測Mp感染的可靠方法之一，但是Mp分離培養(yǎng)對培養(yǎng)環(huán)境要求較苛刻，耗時長，一般培養(yǎng)分離陽性率不高，難以作為臨床常規(guī)項目開展。近年來，Puppe等[5]研發(fā)出快速檢測Mp的培養(yǎng)基，它是利用Mp生長代謝產(chǎn)物讓培養(yǎng)基液體中指示劑從紅色變成澄黃色來判斷Mp生長，快速培養(yǎng)法直接檢測Mp病原體，且培養(yǎng)基中富含高營養(yǎng)和快速生長因子，標(biāo)本中含有微量的病原體就可迅速增殖，大大縮短了培養(yǎng)時間。還有研究報道，該方法檢測Mp的假陽性率較高，但容易被細菌和真菌污染而造成假陽性，故該方法特異性還有待進一步提高，因此有必要在培養(yǎng)48h作第一次判定結(jié)果后轉(zhuǎn)種進一步做一般細菌培養(yǎng)。

2 抗原檢測

Mp抗原檢測方法包括對流免疫電泳(counter immunoelectro-phoresis)﹑免疫印跡(immunoblot-ting)和抗原捕獲EIA(antigen capture enzym eimmunoas-say)，這些方法操作耗時費力，敏感性較低，并且檢測過程中需Mp特異性抗體，不適于臨床檢測。Miyashita N等[6]以不同菌株Mp單克隆抗體作為包被物，采用雙抗體夾心ELISA檢測Mp抗原，同時以PCR法作平行測定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。該方法具有快速﹑簡便﹑靈敏度高﹑特異性強等諸多優(yōu)點，并且和其它支原體沒有交叉反應(yīng)，但同時亦需要特異性好﹑效價高的Mp單克隆抗體，所以未能廣泛普及，目前市場還尚無商品化的Mp抗原檢測試劑盒。

3 血清學(xué)檢測

Mp感染機體后，經(jīng)過免疫反應(yīng)體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgM﹑IgG類抗體，其中IgM抗體在感染1周后可檢測出陽性，3～4周后達高峰，能作為早期感染的診斷指標(biāo)。IgG抗體出現(xiàn)較遲，其濃度峰在Mp感染后的第5周，一般提示有既往感染，單獨檢測意義不大。Mp血清學(xué)檢測主要包括非特異性抗體試驗和特異性抗體試驗[7]。

3.1 非特異性抗體試驗

Mp感染機體后，血清中除出現(xiàn)特異性抗體外，還存在刺激機體產(chǎn)生的非特異性冷凝集素。該凝集素能與O型Rh陰性紅細胞在4℃條件發(fā)生凝集反應(yīng)，血清滴度≥1：64，判為陽性，效價越高或者雙份血清效價呈4倍以上，提示近期Mp感染的可能性較大[8]。非特異凝集試驗操作簡單，但其特異性相對較低，除Mp感染患者外，如流感病毒﹑立克次體和腺病毒等感染也會產(chǎn)生冷凝集素，造成假陽性，因此該方法只可作為輔助診斷Mp感染的方法。

3.2 特異性抗體試驗

Mp 特異性抗體試驗包括補體結(jié)合試驗 (Complement fixation test，CFT)﹑顆粒凝集試驗 (particle agglutination test，PAT ／ PA)﹑間接血凝試驗 (indirect hemagglutination test，IHT)﹑問接免疫熒光試驗 (Immuno-fluorescence test，IFT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme Linked Immunosorbent Assays，ELISA)。

3.2.1 CFT試驗

CFT試驗是最早應(yīng)用于Mp實驗室常規(guī)診斷的試驗方法。Mp的抗原糖脂成分可刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，與Mp抗體結(jié)合后形成固有補體使之不發(fā)生溶血反應(yīng)。該方法以Mp糖脂類抗原為標(biāo)記物，檢測血清中是否存在Mp抗體，其中抗體效價呈倍增長，或單份血清效價≥1：64～1：128者有診斷價值，通常用雙份血清試驗可判定Mp感染是否處于急性期或恢復(fù)期。劉方鶴等[9]報道CFT試驗反應(yīng)穩(wěn)定，敏感性和特異性均好，但較為煩瑣，且以檢測IgM抗體為主，不能檢測IgG等抗體，初次感染時出現(xiàn)陽性率高，再感染者容易出現(xiàn)假陰性，并且在老年體弱患者中，因此，即使CFT試驗呈陰性也不可以排除Mp感染，故臨床應(yīng)用較少。

3.2.2 PA試驗

PA試驗是采用致敏粒子與試驗血清進行孵育發(fā)生凝集的血清學(xué)試驗。雙份血清(間隔2周)抗體滴度呈4倍或4倍以上上升或降低或抗體滴度持續(xù)>1：160時，均可確診為Mp感染，這是目前國際公認的標(biāo)準。我國學(xué)者靳冰等[10]研究結(jié)果顯示PA試驗靈敏度為96.4%，特異性為100%，以及準確度為97.9%，說明PA試驗特異性強，操作簡便，適用于臨床快速診斷，但該方法采用的Mp進口試劑價格昂貴，窗口期不能被檢測，易造成漏檢。

3.2.3 IHT試驗

IHT試驗主要用于檢測IgM抗體，在微量凝血板上被檢血清與血清對照，其余各孔加致敏紅細胞后震蕩混勻，紅細胞凝集程度在“++”﹑血凝抗體滴度≥1：32以上即有診斷意義[11]。李正秋等[12]報道，IHT實驗的靈敏度為97.5%，顯著高于ELISA檢測法86.5%，其特異性70.9%不及ELISA檢測法91.5%，二者聯(lián)合檢測可提高檢測陽性率。該試驗操作方法相對簡單﹑快捷，但因其特異性不高，且與生殖道支原體存在交叉反應(yīng)而未推廣。

3.2.4 IFT試驗

IFT試驗是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。該法以培養(yǎng)基中生長的Mp菌落制作抗原印片，與被檢血清(Mp—IgM﹑IgG抗體)孵育形成抗原抗體復(fù)合物，再用抗抗體的熒光標(biāo)記抗體著色，熒光顯微鏡下觀察，效價>1：16為陽性。有學(xué)者報道IFT試驗檢測Mp感染陽性率為64%，靈敏度為98.3%，特異性為87.5%，明顯優(yōu)于快速培養(yǎng)基法(陽性率26%，靈敏度為33.3%，特異性為85%)，兩方法比較而言，該方法特異性較高，但需購置熒光顯微鏡才能觀察，只適用于一般實驗室[13-16]。

3.2.5 ELISA試驗

ELISA試驗利用酶標(biāo)記抗體作為標(biāo)志物，并將提純的Mp膜蛋白P1﹑P116或P30抗原。吸附在固相載體表面，再用洗滌液將游離成分洗除，最后加入TMB底物后顯色來判斷結(jié)果。ELISA法是國內(nèi)應(yīng)用較為成熟的實驗方法，目前臨床上多應(yīng)用商品化試劑盒來進行快速簡便檢測，Narita Mitsu等[17]研究認為ELISA法具有較好的準確度和特異性，可分別高達96%﹑98%，優(yōu)于CFT法，是診斷Mp感染實用可靠的手段，并且敏感﹑快速，適合于各級臨床實驗室，可作為Mp感染的常規(guī)檢測方法。

4 分子生物學(xué)檢測

自1980年以來，通過實驗室和臨床研究，證實了聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)檢測Mp感染的可靠性，目前PCR技術(shù)也是國內(nèi)外發(fā)展較快的檢測支原體的方法之一。PCR可分為普通PCR﹑實時熒光定量PCR，而普通PCR容易被污染而出現(xiàn)假陽性；實時熒光定量PCR具有快速，特異性強，靈敏度高等特點且無交叉反應(yīng)現(xiàn)象，對Mp感染的診斷價值優(yōu)于普通PCR法。運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測患者痰液﹑咽拭子﹑支氣管灌洗液中的Mp-DNA，通過高溫加熱使模板的兩條DNA鏈解鏈后，引物分別與模板DNA和熒光探針一起退火，通過基因擴增技術(shù)，可以在短時間內(nèi)使含量極低的核酸片段擴展至數(shù)百萬個拷貝，可檢出≥10cfu／mL的Mp。研究[18-24]發(fā)現(xiàn)，PCR診斷Mp感染的陽性率為73%，明顯高于培養(yǎng)法25%，但血清學(xué)陽性率為98.5%，PCR靈敏度不及血清學(xué)，但特異性能達到97%，在Mp感染早期診斷優(yōu)于培養(yǎng)法和血清學(xué)試驗。PCR技術(shù)大大提高了檢測特異性，并且可了解Mp在患者體內(nèi)感染及自我復(fù)制的情況，對早期檢測Mp感染具有重要意義口。但其過于敏感，操作不當(dāng)或環(huán)境因素容易受到污染會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性，另外該技術(shù)要求特殊儀器設(shè)備，較高的人員素質(zhì)，所以在縣級醫(yī)院中難以普及。

5 展望

綜上所述，基于分離培養(yǎng)﹑抗原檢測﹑抗體檢測和基因診斷技術(shù)為Mp感染的診斷提供了非常有效的檢測手段，但迄今為止還尚無統(tǒng)一的Mp實驗室檢測方法。由于各種檢測技術(shù)參差不齊，各種檢測手段都有優(yōu)缺點，建議根據(jù)臨床要求，選擇合適的檢測方法，如Mp初篩可選用靈敏度較高的ELISA法﹑確診可采用特異性較好的分子生物學(xué)診斷方法，同時還可采用多種檢測手段結(jié)合可提高Mp感染陽性檢出率。相信隨著Mp基礎(chǔ)研究的深入以及檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，必將發(fā)現(xiàn)新的Mp檢測靶點，并開發(fā)出更加特異﹑敏感的檢測方法，從而能夠準確﹑快速地診斷Mp感染。