豬體細胞克隆和基因編輯技術(shù)研究

張 展，劉 芳，陳淑慧

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院馬克思主義學(xué)院，廣東 佛山 528000）

體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）是一種將已分化的細胞重編程恢復(fù)其全能性，進而生產(chǎn)與供體細胞基因型完全相同后代的無性繁殖技術(shù)。包括收集并成熟卵母細胞，供體細胞核處理，重構(gòu)胚的體外激活，胚胎的培養(yǎng)和移植等過程。豬的SCNT技術(shù)的建立在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)有廣泛的應(yīng)用。

基因編輯技術(shù)（Gene editing technology）是指利用基因工程的基本原理對動物基因組的靶向基因進行有目的的編碼修飾，并結(jié)合體細胞克隆和胚胎移植等技術(shù)手段，獲得經(jīng)過基因修飾的個體且可穩(wěn)定遺傳給子代的一種生物技術(shù)。此技術(shù)不僅克服了大型動物在傳統(tǒng)育種方面存在的周期長、遺傳效力低等問題，而且在抗病性、肉質(zhì)改善、動物福利及動物疾病模型等研究上都有重要突破。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。文章將對豬體細胞克隆技術(shù)進行概述，從影響其效率的因素應(yīng)用以及同基因編輯的聯(lián)系等方面進行綜述。

1 豬SCNT概述

關(guān)于克隆豬的發(fā)展早期開始于1989年，當時的研究者將減數(shù)分裂中期的卵母細胞中形成的致密morula或blastocys:stage共88個核移植胚胎移植到受體中繼續(xù)發(fā)育，1頭小豬出生。研究表明，細胞核在轉(zhuǎn)移到去核的、激活的減數(shù)分裂中期的卵母細胞后能夠直接發(fā)育到足月。1995年，有研究將低溫保存的原始生殖細胞作為核質(zhì)體在豬體內(nèi)進行核移植。實驗表明低溫保存的原始生殖細胞能夠在72 h內(nèi)進行核重組和卵裂，或者在體外孵育到4細胞期，然后將核轉(zhuǎn)移到去核、激活（S-）或M II期卵母細胞。1997年世界首例體細胞克隆動物——綿羊“Dolly”的誕生標志著哺乳動物體細胞克隆進入一個新的時代。然而，豬的體細胞核移植技術(shù)發(fā)展較為緩慢。美國研究員Polejaeva2000年研究并報道了從培養(yǎng)的成年體細胞群中克隆出仔豬。國內(nèi)方面，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)于1999年成功獲得體細胞克隆豬囊胚，直至2005年我國第1頭體細胞克隆豬誕生，其在國內(nèi)克隆技術(shù)發(fā)展歷程上具有里程碑意義。近年來豬的體細胞核移植技術(shù)逐漸完善，國內(nèi)越來越多的研發(fā)機構(gòu)通過體細胞克隆獲得仔豬，比如，廣西特色小型豬、巴中土豬、太湖豬等。

2 影響豬SCNT技術(shù)的因素

近年來雖然在豬的體細胞克隆上取得了不錯的研究進展，但是考慮其整體的效率，仍舊不理想，這主要與不同供體細胞的來源、卵母細胞的成熟質(zhì)量、胚胎移植操作等方面有關(guān)系。

2.1 供體細胞的影響

在體細胞克隆研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過胎兒成纖維細胞、腎臟細胞、心臟細胞、顆粒細胞、成年豬皮膚成纖維細胞等成功得到了克隆豬，但是不同的供體細胞來源對體細胞克隆的效率有一定影響。潘登科等人利用胎兒成纖維細胞、成年豬耳成纖維細胞和顆粒細胞進行細胞核移植，結(jié)果表明，使用胎兒成纖維細胞和顆粒細胞作為核供體的重構(gòu)胚融合率（72.7%vs.81.5%）與耳成纖維細胞的對應(yīng)結(jié)果差異顯著（62.8%）；Li，Z等以3種類型的供體成纖維細胞在克隆豬的大規(guī)模生產(chǎn)中進行了測試，結(jié)果表明使用胎兒的成纖維細胞可以顯著提高克隆胚胎的妊娠率和分娩率。Tianbin Liu等研究結(jié)果表明胎兒成纖維細胞導(dǎo)致重構(gòu)胚胎率較低（30.38%比37.94%、34.65%和34.87%），但總體效率更高。Z.Hua等利用梅山豬胎兒成纖維細胞成功克隆了克隆豬，其克隆效率優(yōu)于初生仔豬和成年豬成纖維細胞，表明核供體細胞系對梅山豬克隆胚胎的發(fā)育能力和克隆效率均有顯著影響。從以上研究結(jié)果不難看出，在克隆豬方面，雖然有多種細胞形態(tài)可以作為供體細胞進行克隆，但是最為理想的供體細胞仍然是胎兒成纖維細胞。

2.2 受體細胞的影響

通過體外采集到的卵母細胞對豬SCNT的影響主要表現(xiàn)在其成熟后卵母細胞的品質(zhì)，在實驗研究中通常采用體外培養(yǎng)成熟和體內(nèi)自然發(fā)育成熟的卵母細胞。理論上講，自然發(fā)育成熟的卵母細胞要比體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞更為理想，但是體內(nèi)發(fā)育成熟的卵母細胞難以獲取且價格昂貴；體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞雖然價格便宜、易獲取，但是移植效率低。有研究表明，以體內(nèi)和體外成熟卵母細胞作為核移植受體構(gòu)建的克隆胚胎二者的胚胎融合率和卵裂率均無顯著差異，但體內(nèi)成熟卵母細胞囊胚率高于體外成熟卵母細胞。然而，在臨床試驗或者實際應(yīng)用中仍然以體外成熟的卵母細胞作為核移植受體的主要來源。在馬的相關(guān)研究中，有研究表明，供體動物的年齡以及細胞的儲存條件和時間對卵母細胞的質(zhì)量有很大影響。在克隆豬方面，有研究表明卵丘細胞會影響卵母細胞內(nèi)的谷胱甘肽合成，影響卵母細胞成熟后的品質(zhì)。

此外，豬卵母細胞成熟的又一影響因素是卵泡液的成分。根據(jù)不同質(zhì)量的卵母細胞制訂最優(yōu)的體外成熟方案，有助于獲得較高的成熟率。有實驗研究表明黃芩苷可以通過抑制促凋亡相關(guān)基因（Bax）mRNA，提高卵母細胞體外成熟能力和質(zhì)量。用甲基-β環(huán)糊精（CLC）預(yù)處理可以提高豬卵母細胞的存活率和成熟率。JiEunPark等發(fā)現(xiàn)軟性瓊脂糖基質(zhì)能有效抑制卵母細胞和胚胎的凋亡。

2.3 胚胎移植數(shù)量和方法對SCNT效率的影響

胚胎移植技術(shù)是影響克隆豬生產(chǎn)效率的諸多因素中最為重要的因素之一。進行核移植后的重構(gòu)胚，融合激活，在體外培養(yǎng)后通過腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù)、開腹手術(shù)或非手術(shù)方法等移植到代孕母豬的子宮內(nèi)，發(fā)育成為個體。肷窩部開腹手術(shù)的方法是目前應(yīng)用最多的豬胚胎移植方法，其易于學(xué)習(xí)操作簡單，但是開腹手術(shù)可能導(dǎo)致腸壁、腹膜等粘連的風(fēng)險，且在手術(shù)中應(yīng)考慮的諸多因素，比如麻醉、術(shù)后護理等都會對胚胎移植的效果造成影響，不利于代孕母豬的再次利用。2014年有研究對手術(shù)法胚胎移植進行優(yōu)化，在一定程度上提高了克隆效果。非手術(shù)方法胚胎移植最早的成功案例在1989年，但是至今仍沒有廣泛應(yīng)用，主要是因為母豬的子宮頸皺褶和子宮彎曲。2004年，國外某科研機構(gòu)發(fā)明了一種新的非手術(shù)胚胎移植器械，并報道其在代孕母豬的妊娠率達到70.8%，平均窩產(chǎn)仔豬6.9頭。有研究表明通過非手術(shù)子宮深部移植的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)增加了更多的玻璃化胚胎的功能，且代孕母豬的胎次不影響其生殖性能，并不影響代孕母豬重新引種到豬場做種畜的繁殖潛力。以上的研究為非手術(shù)胚胎移植在豬只的廣泛應(yīng)用提供了新的可能性。

此外，豬是多胎動物，每窩懷孕3～5胎以上才能夠維持妊娠，所以胚胎移植數(shù)目對克隆的效率起到一定的決定作用，有研究表明將過量的（250～450個）克隆胚胎移植到個體代孕者身上對提高效率并無作用，移植到個體受體上的重構(gòu)胚胎的最優(yōu)數(shù)量為200～249個。CholHoRim等研究表明，與移植150～200個或超過200個的胚胎相比，100～150個的胚胎移植導(dǎo)致懷孕率顯著升高，該研究沒有一次移植更多的胚胎作為對比，且該研究認為與單側(cè)輸卵管移植相比，雙側(cè)輸卵管移植顯著提高了母豬繁殖效率，此結(jié)論目前尚有爭議，且雙側(cè)移植臨床上不便操作。

3 基因編輯和豬SCNT的應(yīng)用

理論上講，基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是不同的。近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)特指將外源基因轉(zhuǎn)入到受體生物中的技術(shù)，而狹義的基因編輯則相對地特指轉(zhuǎn)基因之外的對生物體基因組目標基因的特定修飾。2002年以克隆胚胎成纖維細胞系作為核供體，用去核豬卵母細胞重建胚胎的首例基因敲除豬誕生。除了SCNT方法外，成功獲得轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)還有原核顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。但是，目前就整體效率而言，SCNT仍然是獲得轉(zhuǎn)基因動物的主要方法。近年來隨著包括鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALENs）及CRISPR/Cas9技術(shù)等多種基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)的發(fā)展，為基因修飾豬構(gòu)建研究提供了技術(shù)支持，同時也為其在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展開更多深入的研究打下基礎(chǔ)。

豬體細胞克隆技術(shù)首先可用于畜牧業(yè)，作為一種方便、有效的方法來提高種群的質(zhì)量，加速遺傳改良；同時保護瀕危滅絕物種是體細胞克隆的另一個潛在應(yīng)用。為了達到高質(zhì)量豬肉蛋白供應(yīng)，可通過基因編輯和SCNT技術(shù)相結(jié)合培育滿足理想生產(chǎn)性能的豬，提高豬的抗病能力，改善豬肉營養(yǎng)價值和豬肉生產(chǎn)，例如：抗豬藍耳病的基因編輯克隆豬、增加對非洲豬瘟抗性克隆豬等。

其次，豬的SCNT技術(shù)和基因編輯技術(shù)相結(jié)合在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，隨著以 CRISPR/Cas9 為主的多種CRISPR系統(tǒng)的不斷研發(fā)和改進，基因編輯技術(shù)逐漸完善，對人類疾病動物模型的制備有重要意義。為某些人類疾病的發(fā)病機理、病理變化、臨床癥狀以及治療等的研究提供參考。也可制作轉(zhuǎn)基因豬生物反應(yīng)器，利用膀胱、乳腺等合成人生長激素、重組蛋白、藥用蛋白和重組抗體等。自20世紀80年代中期引進慢性免疫抑制藥物以來，臨床移植已成為終末期器官衰竭的首選治療方法之一。解決人體器官供應(yīng)有限問題的一種新方法是利用替代物種作為器官來源。出于對倫理、繁殖特性、傳染病、解剖結(jié)構(gòu)以及生理功能的考慮，并且小型豬在外科操作上更加便利，豬被認為是主要的替代物種。通過基因編輯獲得克隆豬的心、腎等器官，可以使異物種器官移植后隨之而來的超急性排斥反應(yīng)大大降低。

4 小結(jié)

自2000年第1頭體細胞克隆豬誕生以來，雖然體細胞克隆技術(shù)不斷更新、發(fā)展，相關(guān)理論研究和技術(shù)優(yōu)化也取得長足進展，但是目前該技術(shù)相關(guān)機制仍不明確，生產(chǎn)效率低，新生仔豬會仍出現(xiàn)器官發(fā)育異常、呼吸困難、骨骼發(fā)育不完善等先天性疾病。造成這些情況的原因有很多，例如文中所述，但普遍認為是表觀遺傳學(xué)重編程不完全或異常造成。相信隨著SCNT技術(shù)的不斷深入研究、完善，并且隨著新的基因編輯技術(shù)的不斷創(chuàng)新，促進基因修飾豬的研究新發(fā)展，廣泛應(yīng)用于豬的精準育種以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并取得一定的成果。