毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

劉培培，楊繼遠(yuǎn)，郭全海

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000）

為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量和加強(qiáng)對(duì)病蟲害的防治，農(nóng)藥已經(jīng)被廣泛使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中。但是農(nóng)藥在短時(shí)間內(nèi)很難被完全分解，所以在農(nóng)作物中乃至土壤中都會(huì)有農(nóng)藥殘留。過(guò)多農(nóng)藥殘留會(huì)影響人體健康，破壞生態(tài)環(huán)境，因此必須控制農(nóng)藥殘留量，加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥使用的監(jiān)督。文章將針對(duì)使用毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）和毛細(xì)管點(diǎn)色譜技術(shù)（Capillary Electrochromatography，CEC）進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)的應(yīng)用展開研究，并且結(jié)合樣品富集技術(shù)、檢測(cè)方法對(duì)CE 和CEC在農(nóng)殘檢測(cè)過(guò)程中的應(yīng)用。

1 毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜檢測(cè)方法

農(nóng)藥化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種化學(xué)物質(zhì)，對(duì)于監(jiān)測(cè)方法要求較高，需要能同時(shí)監(jiān)測(cè)多種化學(xué)物種，并保證檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性。目前常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）和免疫分析法等[1-2]。這些方法都能科學(xué)檢測(cè)藥物殘留情況，但是監(jiān)測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。為解決這一問(wèn)題，CE 逐漸走進(jìn)人們的視線。

CE 是根據(jù)帶電粒子在電場(chǎng)中受到力的作用并且不同帶電成分在電場(chǎng)中的速度不同的原理，把不同的成分進(jìn)行分離[3-4]。CEC 結(jié)合了HPLC 和CE 的優(yōu)點(diǎn)，具有選擇性高、分離效率快和選擇性好等突出優(yōu)點(diǎn)。這2項(xiàng)技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就得到了廣泛的應(yīng)用，大大降低對(duì)樣品劑量的依賴，減少經(jīng)濟(jì)成本并且最大限度地提高檢測(cè)速度。

2 樣品富集技術(shù)

為了滿足檢測(cè)的要求，在檢測(cè)前需要富集樣品，目前常用的預(yù)富集技術(shù)主要有離線富集和在線富集2種。

2.1 離線富集

目前在CE 和CEC 檢測(cè)中離線富集技術(shù)種類多樣，最常用的3 種技術(shù)是液-液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）、固相萃?。⊿olid Phase Extraction，SPE）和固相微萃?。⊿olid Phase Microextraction，SPME）技術(shù)。

LLE 是使用最早的離線富集法，該方法可以利用有機(jī)溶劑對(duì)不易溶于水的物質(zhì)進(jìn)行提取，但是存在耗時(shí)長(zhǎng)、工序復(fù)雜和有機(jī)溶劑容易造成污染等問(wèn)題。

SPE技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行萃取和濃縮，并且操作裝置簡(jiǎn)化，萃取時(shí)所需的溶劑量較LIE 技術(shù)明顯減少，但是操作復(fù)雜等問(wèn)題仍然沒(méi)有解決。SPME 是在SPE 基礎(chǔ)上改進(jìn)得來(lái)，既具有SPE 的傳統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)又克服了SPE操作復(fù)雜等問(wèn)題，重現(xiàn)性得到了改進(jìn)。

2.2 在線富集

在線富集技術(shù)也是富集技術(shù)的一種，常用的在線富集技術(shù)有常規(guī)樣品堆積（Normal Sample Stacking，NSS）、場(chǎng)放大樣品堆積（Field Amplifies Sample Stacking，F(xiàn)ASS）和大體積樣品堆積（Ligasure Vessel Sealing System，LVSS）。

NSS是通過(guò)堆積形式實(shí)現(xiàn)檢待檢測(cè)物質(zhì)的富集。根據(jù)離子在不同性質(zhì)的電導(dǎo)介質(zhì)中電泳速度會(huì)發(fā)生突變的原理從而實(shí)現(xiàn)富集。

LVSS 是在外部壓力作用下對(duì)大量的樣品進(jìn)行壓力作用或者電滲流的方法實(shí)現(xiàn)富集。該方法的富集效果是非常顯著的，富集因子可以提高到100以上，并檢出限大幅度降低。

FASS是在LVSS模式基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。該方法采取電動(dòng)進(jìn)樣的方式，與壓力進(jìn)樣相比該進(jìn)樣方式打破了注入體積的限制，富集效果顯著并且使檢測(cè)靈敏度得到大幅度提升。

3 不同的檢測(cè)方法及其應(yīng)用

CE 和CEC 可以與多件不同的檢測(cè)器聯(lián)合使用，根據(jù)不同的需求應(yīng)用于不同的檢測(cè)場(chǎng)景，常見的檢測(cè)器如下。

3.1 紫外檢測(cè)

UV 檢測(cè)器在CE 和CEC 中使用非常普遍。UV 檢測(cè)分為紫外檢測(cè)、間接紫外檢測(cè)和二極管陣列檢測(cè)等不同檢測(cè)方法，其中應(yīng)用最廣泛的是直接紫外檢測(cè)方法?，F(xiàn)階段在農(nóng)藥殘留時(shí)采用的檢測(cè)器多為UV 檢測(cè)器，該方法被廣泛使用主要是因?yàn)槠渚哂胁僮骱?jiǎn)單和可靠性高等特點(diǎn)。但是受到紫外波長(zhǎng)的限制，其檢測(cè)的靈敏度有限，需要通過(guò)結(jié)合富集技術(shù)的使用才能提高檢測(cè)靈敏度。

3.2 熒光檢測(cè)

不同于UV 檢測(cè)，熒光檢測(cè)打破紫外檢測(cè)受到光學(xué)限制的弊端，檢測(cè)靈敏度也隨之提高。由于藥物種類的不同，有些藥物自身無(wú)熒光或難以實(shí)現(xiàn)熒光化，對(duì)此類藥物可以通過(guò)間接熒光法進(jìn)行檢測(cè)。目前掌握的技術(shù)手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)地下水中的草甘膦，仍然需要借助預(yù)處理手段進(jìn)行預(yù)處理后才能完成后續(xù)的檢測(cè)。

3.3 質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)與CE 和CEC 相結(jié)合，可以提高分離速度和降低樣品使用量，同時(shí)可以獲取精確的相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)信息。該方法已經(jīng)成為非常穩(wěn)定和可靠的農(nóng)藥殘留檢測(cè)手段，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。

3.4 電化學(xué)檢測(cè)

常見的檢測(cè)方法除上述3種外還有電化學(xué)檢測(cè)法。電化學(xué)檢測(cè)法還可以細(xì)化，例如安培法、電導(dǎo)法和電致化學(xué)發(fā)光法（Electrochemiluminescence，ECL）等。安培法可以與CE 結(jié)合應(yīng)用，提高檢測(cè)的靈敏度。安培檢測(cè)法限制條件少，可以檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。

電導(dǎo)檢測(cè)法是通過(guò)檢測(cè)電導(dǎo)率變化而形成的電泳分離譜圖進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)，在進(jìn)行無(wú)機(jī)物成分的檢測(cè)時(shí)該方法使用較多，在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方面相對(duì)應(yīng)用較少。

ECL 利用能量轉(zhuǎn)換的原理實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中將電能轉(zhuǎn)化為輻射能。該方法具有儀器簡(jiǎn)便、靈敏度高和易于集成等特點(diǎn)?，F(xiàn)階段已經(jīng)將電化學(xué)法作為CEC 檢測(cè)應(yīng)用于魚累獸藥殘留檢測(cè)，但是還沒(méi)有關(guān)于在農(nóng)藥殘留方面的應(yīng)用。

4 手性農(nóng)藥的分離與檢測(cè)

研究結(jié)果顯示，現(xiàn)使用的農(nóng)藥具有普遍的光學(xué)異構(gòu)體，即使是同種農(nóng)藥不同的對(duì)映體也會(huì)造成藥效有很大的差異。因此，會(huì)造成一個(gè)異構(gòu)體在目標(biāo)生物和非目標(biāo)生物之間表現(xiàn)出來(lái)的毒性差異很大，并且不同生物對(duì)其降解能力不同，但是現(xiàn)階段農(nóng)藥的主要使用形式仍然是外消旋體形式，針對(duì)此需要手性拆分檢測(cè)農(nóng)藥。由于CE 和CEC 技術(shù)在手性拆分檢測(cè)方面表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢(shì)，從而在農(nóng)藥檢測(cè)方面?zhèn)涫荜P(guān)注。

Jarman 和Garrrison 等通過(guò)在土壤的沉淀物中加入手性農(nóng)藥從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其轉(zhuǎn)化規(guī)律的有效研究。在該研究過(guò)程中以CZE模式為基礎(chǔ)，選取γ-CD作為手性檢測(cè)劑，最終手性分離檢測(cè)了甲霜靈。以毛細(xì)管電動(dòng)色譜（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MEKC）模式為基礎(chǔ)利用γ-CD 和二甲基β-CD 手性選擇劑，手性分離測(cè)定地蟲硫磷和滅草喹的同分異構(gòu)體。研究結(jié)果表明，甲霜靈的分離效果與環(huán)境因素關(guān)聯(lián)較大，但是地蟲硫磷和滅草唾的分離則幾乎不受環(huán)境因素影響。除此以外，Klein 和Aga 等同樣通過(guò)CZE 模式為基礎(chǔ)，以γ-CD 手性選擇劑和光電二極管陣列檢測(cè)器（Photo Diode Array，PDA），手性分離檢測(cè)了異丙甲草胺及其代謝產(chǎn)物。

目前，國(guó)內(nèi)CE拆分對(duì)手性藥物殘留的研究越來(lái)越多，CE在農(nóng)藥手性拆分上表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)被越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)并通過(guò)試驗(yàn)證明。游靜和歐慶瑜等通過(guò)采用帶電的磺丁基-β-CD 對(duì)殺鼠靈和水胺硫磷進(jìn)行了對(duì)映體拆分。Yi 和Lin 等通過(guò)研究掌握了快速有效的分離辦法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤中的滅草喹及其分解物質(zhì)所形成的同分異構(gòu)體檢測(cè)。試驗(yàn)過(guò)程中主要研究了酸堿度、緩沖液濃度和手性選擇劑的種類和濃度，以及分離電壓和溫度等因素對(duì)于分離結(jié)果的影響。據(jù)研究結(jié)果分析，土壤pH 值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響最為顯著。除此以外，針對(duì)土壤中2 種烯菌靈對(duì)映體進(jìn)行了類似方法的分解情況檢測(cè)。本課題研究組還從非水相以及水與有機(jī)溶劑混合相等2 個(gè)方面對(duì)含有有機(jī)磷成分的農(nóng)藥進(jìn)行對(duì)映體分析，結(jié)果表明所選取的4 種不同有機(jī)磷農(nóng)藥吡唑硫磷、丙溴磷、丙硫磷和甲丙硫磷在非水溶劑中分離結(jié)果更加理想，分離地更為徹底。因此，可以通過(guò)以上方法對(duì)土壤中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定。

CEC 在農(nóng)藥殘留方面的手性分離應(yīng)用雖然較少，但隨著生物科技技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)于農(nóng)藥殘留認(rèn)知的不斷提高，推動(dòng)了其在農(nóng)藥殘留手性分析方面的應(yīng)用。Messina 等利用CEC 方法對(duì)土壤中的2，4-滴丙酸（DCPP）進(jìn)行測(cè)定,并且利用原位共聚的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)多空手性柱的整體合成。在此基礎(chǔ)上鍵接上（1）-1-（4-氨基丁基）-（5R，8S，10R）-特麥角脲作為手性選擇劑。研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)23 d 分解后，土壤中的DCPP 會(huì)有20%被分解，并且不同類型表現(xiàn)出的分解速度明顯不同，S 型相較于R 型在分解速度上具有明顯優(yōu)勢(shì)。在該試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上對(duì)2-芳氧基丙酸除草劑的對(duì)映體也進(jìn)行了分解和殘留情況的測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，手性對(duì)映體在較短的時(shí)間內(nèi)就可以實(shí)現(xiàn)很好的分解，通常5 min 即可達(dá)到理想的分解。Andre 和Guillaume 等將一種源于LRNA的核酸適配體進(jìn)行手性固定，在多孔玻璃小球上進(jìn)行分解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一系列的除草劑分子的檢測(cè)，該固定相在試驗(yàn)中表現(xiàn)出穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)明顯。

5 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)階段農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法仍然是利用紫外檢測(cè)法和熒光檢測(cè)法與CE 和CEC 技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，尤其是CEC 在農(nóng)藥殘留方面的聯(lián)合應(yīng)用仍然非常的少見。紫外檢測(cè)法主要受限于自身的檢測(cè)靈敏度低，無(wú)法單獨(dú)使用進(jìn)行農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。通常紫外檢測(cè)法需要和富集技術(shù)結(jié)合使用，先對(duì)待檢測(cè)物品中進(jìn)行富集處理，然后再檢測(cè)。這樣盡管可以達(dá)到檢測(cè)農(nóng)藥殘留的目的，但是也會(huì)伴隨著富集技術(shù)的使用，從而產(chǎn)生耗材和試劑費(fèi)用，同時(shí)也使檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)。因此，需要不斷研究，提高檢測(cè)的靈敏度，比如化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法和電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等可以與CE 和CEC 的聯(lián)用，并將其應(yīng)用在農(nóng)殘的分離檢測(cè)中；或者可以通過(guò)檢測(cè)器之間的聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。

手性農(nóng)藥在農(nóng)藥的使用中占比可達(dá)25%，但是對(duì)其有關(guān)的研究仍然較少，尤其是應(yīng)用CEC 對(duì)手性農(nóng)藥進(jìn)行分離檢測(cè)的研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)仍較少，需要更多的學(xué)者進(jìn)行相關(guān)方面的深入研究。

隨著研究的不斷深入，CE 和CEC 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為分離速度快、效率高、成本低以及操作簡(jiǎn)單。隨著樣品濃縮技術(shù)的推廣CE和CEC 在監(jiān)測(cè)靈敏度方面的缺陷已經(jīng)得到較好地解決，使用樣品濃縮技術(shù)以及更加靈敏的檢測(cè)方法使CE 和CEC 技術(shù)的檢測(cè)靈敏度不夠的問(wèn)題已經(jīng)逐漸得到解決。相信通過(guò)廣大學(xué)者的不斷努力和芯片相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，CE 和CEC 檢測(cè)農(nóng)殘技術(shù)就可以成為常規(guī)的檢測(cè)方法。