簡(jiǎn)析非洲豬瘟病毒快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

董紅艷

（河北省廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 065000）

非洲豬瘟(African Swine fever,East African Swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起，ASFV 是一類復(fù)雜的DNA病毒，直徑較大，能達(dá)到175～210nm。成熟體有兩層以上衣殼，外部包裹囊膜。該病毒是現(xiàn)在已知唯一的昆蟲媒介DNA病毒。經(jīng)細(xì)胞迭代或血清阻斷后可喪失吸附特性。

1 非洲豬瘟的性質(zhì)及危害

非洲豬瘟（ASF）最早在非洲肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，目前在非洲、歐洲、美洲的幾十個(gè)國(guó)家流行，在我國(guó)東部、東北部和西南部也有非洲豬瘟疫情傳播。該病在臨床上存在全身出血、發(fā)熱、神經(jīng)系統(tǒng)障礙等癥狀，并有以下幾個(gè)特點(diǎn)，發(fā)病時(shí)間短、傳染速度快、致死率高等。所有品種、年齡的野豬或家豬一旦接觸都可能感染ASFV 病毒，該病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)影響極大，給農(nóng)民與養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益以沉重打擊，還拉動(dòng)了豬肉價(jià)格急劇上漲，抬高了物價(jià)，給國(guó)家正常的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不小損失。

目前，還沒有研制出針對(duì)ASFV 的特效藥，由于ASFV 病毒基因組十分復(fù)雜，其不同毒株的基因組長(zhǎng)度可能在171～191kb 之間，編碼151～166 個(gè)閱讀框，基本可分為24 個(gè)基因型。變異可能性較高，具有逃逸免疫機(jī)制，對(duì)病毒作用于宿主的過程也不清楚，所以其疫苗研發(fā)進(jìn)度極為緩慢?，F(xiàn)今的防控基本以加強(qiáng)隔離、減少接觸、屠宰帶病牲畜、對(duì)養(yǎng)殖地帶進(jìn)行全方位消殺等手段為主。所以，對(duì)于ASFV 病毒的早期識(shí)別與檢測(cè)顯得極為重要。

2 非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)方法

2.1 從病原著手實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)方法

2.1.1 病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)

病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)是最傳統(tǒng)的檢測(cè)方法之一，有“金標(biāo)準(zhǔn)”的美譽(yù)。操作方法：一般先將疑似的ASFV 樣本接種于單核細(xì)胞或合適的原代細(xì)胞中，培養(yǎng)期間，根據(jù)病毒增殖情況可適量添加生長(zhǎng)因子、血清等，最終獲得分離出來的毒株。對(duì)其進(jìn)行鑒定，一般出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象48～72h 后，細(xì)胞出現(xiàn)病變情況即可說明疑似樣本中含有ASFV。

2.1.2 熒光抗體檢測(cè)技術(shù)

熒光抗體檢測(cè)（FAT）也是常用的一種檢測(cè)方式，其特點(diǎn)是較為經(jīng)濟(jì)，檢測(cè)時(shí)間較短。原理是使用熒光色素結(jié)合抗體檢測(cè)，將疑似感染的ASFV 樣本固定于顯微鏡下，加入血清，血清中被熒光素標(biāo)記的抗體即可與樣本中的抗原相結(jié)合，但由于該方式必須使用顯微鏡，不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)[1]。

2.1.3 紅細(xì)胞吸附檢測(cè)技術(shù)

ASFV 病毒在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染期間會(huì)發(fā)生吸附紅細(xì)胞（HAD）的現(xiàn)象，因此，細(xì)胞病變之前能觀察到紅細(xì)胞形成的特殊圖像。紅細(xì)胞吸附檢測(cè)是世界衛(wèi)生組織推薦的ASFV 檢測(cè)方法之一，時(shí)間較短，只需要4～10h，但ASFV 病毒中也存在沒有HAD 現(xiàn)象的毒株，因此，這種檢測(cè)技術(shù)逐漸被PCR 檢測(cè)技術(shù)所代替。

2.2 核酸檢測(cè)技術(shù)

ASFV 病毒的核酸檢測(cè)技術(shù)分為多種，如PCR 檢測(cè)技術(shù)、熒光定量PCR 技術(shù)、微滴數(shù)字PCR 技術(shù)、LAMP 技術(shù)等。

2.2.1 PCR 檢測(cè)技術(shù)

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，PCR 是檢測(cè)ASFV 病毒應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，該方法簡(jiǎn)單高效、經(jīng)濟(jì)性好，能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，該技術(shù)根據(jù)較為復(fù)雜的基因型來設(shè)計(jì)，因此，能檢測(cè)出各類基因型的ASFV 病毒，而且這種檢測(cè)技術(shù)不僅能檢出宿主樣品中的ASFV 病毒，甚至能對(duì)攜帶病毒的昆蟲進(jìn)行檢驗(yàn)，敏感性較高。

當(dāng)PCR 反應(yīng)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)人員需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行觀察，看是否存在特異性條帶物，這一過程需要開啟器皿，容易污染成品，造成假陽性的情況。而在臨床試驗(yàn)中，樣品也有多種成分可能抑制PCR 反應(yīng)，造成假陰性的結(jié)果。因此，在進(jìn)行PCR 反應(yīng)前，試驗(yàn)人員需要對(duì)疑似感染樣品，包括其中的血紅素、代謝物、酸性多糖與糖蛋白組分進(jìn)行預(yù)處理。

2.2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)

熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)（qPCR）操作步驟較為簡(jiǎn)單，試驗(yàn)流程較為方便，檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，該方法即在普通PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行添加熒光色素或熒光探針，利用熒光來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 反應(yīng)過程，并進(jìn)行記錄。通過這種方法，可以對(duì)普通PCR 反應(yīng)中的樣品進(jìn)行定量分析，使其更加敏感、高效，并且該方法只對(duì)ASFV 病毒生效，其他病毒如豬口蹄疫病毒、禽流感病毒等都為陰性。整個(gè)檢測(cè)過程可縮短至1h 以內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，極大提高了檢測(cè)人員的工作效率，為識(shí)別ASFV 病毒提供了切實(shí)有效的措施。

2.2.3 微滴數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)

微滴數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)（ddPCR）是一種新興技術(shù)，對(duì)樣品的核酸分子進(jìn)行定量檢測(cè)，與熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)相比，該技術(shù)不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，目前，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類動(dòng)物病毒的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，鄔旭龍等針對(duì)K205r 基因組建立的微滴數(shù)字PCR 技術(shù)，其最低可以達(dá)到0.36 拷貝，也不會(huì)與其他動(dòng)物病毒或樣品成分發(fā)生反應(yīng)，敏感度較高，檢測(cè)效率較好。但該方法需要昂貴的檢測(cè)儀器設(shè)備，并有較為嚴(yán)格的專業(yè)技術(shù)要求，只適合于潛伏期的病毒檢測(cè)和小規(guī)模測(cè)試。

2.2.4 LAMP 技術(shù)

LAMP 技術(shù)是在體外恒溫的條件下完成的檢測(cè)方法，用肉眼即可判斷檢測(cè)結(jié)果，避免使用實(shí)驗(yàn)儀器，加快了檢測(cè)速度，降低了檢測(cè)成本，對(duì)其他牲畜病毒也不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，比較適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[2]。

2.3 從抗體著手實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)方法

2.3.1 ELISA 檢測(cè)技術(shù)

酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA）是世界衛(wèi)生組織指定使用的抗體檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是方便、快速，并可脫離人工，使用電子設(shè)備就能實(shí)現(xiàn)大批量檢測(cè)。在西方，ELISA 技術(shù)的使用歷史較長(zhǎng)，從20 世紀(jì)70 年代末就已經(jīng)開始了。在國(guó)內(nèi)目前的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境多采用間接ELISA 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。鄔旭龍等利用PK205R 作為包被抗原，建立了一種較為快速的間接ELISA 技術(shù)，該技術(shù)特異性較高，敏感性也較好，變異系數(shù)一般小于10%，優(yōu)化了反應(yīng)條件，提高了檢測(cè)效率。

2.3.2 膠體金免疫試紙檢測(cè)技術(shù)

膠體金免疫試紙檢測(cè)技術(shù)利用膠體金顆粒作為免疫標(biāo)記，結(jié)果可利用肉眼進(jìn)行分辨，不需要儀器設(shè)備，具有快捷方便、效率較高的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)目前的免疫試紙制備已達(dá)到較為先進(jìn)的水平，敏感性高，與其他病毒無交叉反應(yīng)，在基層或現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)環(huán)境中擁有較好的前景。林彥星等制備的免疫層析試紙條與進(jìn)口ELISA 檢測(cè)技術(shù)的臨床對(duì)比率已達(dá)到100%。

2.4 其他病毒檢測(cè)方法

如免疫印跡檢測(cè)法，其原理與熒光抗體檢測(cè)技術(shù)類似，敏感度較高，適應(yīng)性較強(qiáng)，與其他病毒不發(fā)生反應(yīng)。但需求較為苛刻的實(shí)驗(yàn)條件與較為先進(jìn)的儀器設(shè)備，不利于基層快速檢測(cè)。

Abad 設(shè)計(jì)了一種晶體式生物傳感器進(jìn)行ASFV 病毒的抗體檢測(cè)，可在半小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。Luminex 懸浮芯片技術(shù)以不同比例的熒光材料標(biāo)記出不同抗體分子，與感染樣品結(jié)合后由流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。其敏感度與效率高于ELISA 檢測(cè)法[3]。

2.5 各類檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

目前，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中應(yīng)用最為廣泛的還是PCR 檢測(cè)技術(shù)與熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)，病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)雖然檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，特異性較高，但時(shí)間過長(zhǎng)，不利于疫情的快速控制。有部分ASFV 毒株不存在吸附紅細(xì)胞的現(xiàn)象，因此，應(yīng)與PCR 結(jié)合使用。膠體金免疫試紙檢測(cè)法雖然速度快，適用于基層快速檢測(cè)，但試紙容易污染，最終結(jié)果還應(yīng)結(jié)合PCR 檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行判斷。LAMP 技術(shù)由于需要打開器皿進(jìn)行觀察，更易造成產(chǎn)物污染，發(fā)生假陰性或假陽性現(xiàn)象。

3 結(jié)論

非洲豬瘟已在世界范圍內(nèi)大規(guī)模傳播，有效藥與疫苗的研制也遙遙無期，我們要做好打一場(chǎng)防控持久戰(zhàn)的準(zhǔn)備。一方面，應(yīng)積極進(jìn)行ASFV 病毒檢測(cè)方法的不斷探索，提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)誤差。另一方面，應(yīng)努力推進(jìn)疫苗與藥物的研發(fā)，爭(zhēng)取早日攻克這一影響畜牧業(yè)發(fā)展的頑固病毒。