循環(huán)腫瘤細(xì)胞在結(jié)直腸癌預(yù)后及療效評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展

張昶 韓超 黃南祺 吳小兵 徐學(xué)虎

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常見癌癥和第四大癌癥相關(guān)死亡病因［1］。我國(guó)的CRC 綜合發(fā)病率和死亡率分別排第三位和第五位，且總體仍呈上升趨勢(shì)［2］。研究顯示，結(jié)直腸癌在診斷時(shí)已有約1/4 患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，接受治療的患者中仍有約一半發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。目前，結(jié)直腸鏡與組織病理學(xué)檢查由于侵入性高，難以為患者提供精準(zhǔn)的預(yù)后信息［4］。結(jié)直腸癌的療效評(píng)價(jià)主要以影像學(xué)檢查RECIST1.1 為標(biāo)準(zhǔn)，但由于費(fèi)用高及滯后性等因素影響，實(shí)用性并不高；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果也僅用于參考［5］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是因各種原因脫離原發(fā)實(shí)體腫瘤，進(jìn)入血液并游離其中的腫瘤細(xì)胞。CTCs 可在靶器官增殖并形成轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官的繼發(fā)性腫瘤，故CTCs 與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移緊密相連。CTCs 的基本檢測(cè)方法為從患者的體液樣本中獲取生物標(biāo)志物，又被稱為“液體活檢”［6］，其中外周血最為常見。與傳統(tǒng)組織病理學(xué)檢查相比，CTCs 檢測(cè)具有微創(chuàng)、易于重復(fù)、取材簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可發(fā)現(xiàn)早期難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移［7］。目前CTCs 已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于監(jiān)測(cè)乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展以及臨床評(píng)估患者的預(yù)后與治療療效［8］。本文就CTCs 在結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)估與療效評(píng)價(jià)中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述。

1 CTCs 檢測(cè)與富集技術(shù)

1.1 標(biāo)記依賴性檢測(cè)技術(shù)

CTCs 檢測(cè)和分離最廣泛使用的方法是基于免疫親和力的檢測(cè)。由于CTCs 不同程度表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）等上皮標(biāo)志物，上皮標(biāo)志物抗體可與磁性納米顆粒偶聯(lián)或修飾在微流控芯片的溝道上，通過(guò)陽(yáng)性或陰性富集策略進(jìn)行CTCs 捕獲［9］。標(biāo)記依賴性檢測(cè)技術(shù)的代表性平臺(tái)之一是CellSearch 系統(tǒng)，它使用EpCAM 包被的納米磁珠來(lái)選擇EpCAM 陽(yáng)性的細(xì)胞，再通過(guò)免疫染色確認(rèn)CK8、18 的高表達(dá)和CD45 的不表達(dá)的CTCs［10］。Cohen 等［11］利用Cell?Search 系統(tǒng)檢測(cè)了430 例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（meta?static colorectal cancer，mCRC）患者外周血中CTCs 數(shù)量，得出CTCs 數(shù)量是影響mCRC 患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression?free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的獨(dú)立因素。AdnaTest平臺(tái)（AdnaGen AG，Langenhagen，德國(guó)）則依賴于抗體混合物包被的磁珠，以增強(qiáng)結(jié)直腸癌中CTCs的捕獲和富集；再通過(guò)多重反轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)技 術(shù)（reverse transcription?polymerase chain reac?tion，RT?PCR）檢測(cè)各種基因（如HER?2、MUC?1和KRAS）的突變［12］。該平臺(tái)通過(guò)結(jié)合兩種方法來(lái)提高CTCs 檢測(cè)的靈敏度以及更好的異質(zhì)性表征。CellMax 檢測(cè)平臺(tái)是一種基于微流控芯片技術(shù)的單一特異性的EpCAM 依賴性檢測(cè)方法，可從外周血中準(zhǔn)確富集CTCs。Tsai 等［13］通過(guò)CellMax平臺(tái)將捕獲的CTCs 計(jì)數(shù)與不同CRC 分期（腺瘤，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）相關(guān)聯(lián)，結(jié)果在各階段均顯示出高特異性（86%），驗(yàn)證了其作為早期癌癥檢測(cè)方法的可靠性。

1.2 基于CTCs 物理特性的檢測(cè)技術(shù)

CTCs 的細(xì)胞分析顯示，與正常細(xì)胞相比，CTCs 的生物物理特性表現(xiàn)出明顯不同。它們具有更大的核漿比、更大的尺寸、不同的核形態(tài)，以及與正常細(xì)胞不同的電學(xué)特性［14］。物理法可不依賴表面標(biāo)記物富集到更多子類的CTCs，具有廣闊前景。ISET（RareCells Diagnostics，Paris，法國(guó)）是利用CTCs 細(xì)胞大小及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的剛性特性進(jìn)行分離富集的平臺(tái)，其主要優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高，所需血液標(biāo)本量少，可在不破壞細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上分離上皮細(xì)胞［15］。OncoQuick（Greiner Bio?One International GmbH，F(xiàn)rickenhausen，德國(guó)）和Ficoll?Paque（GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，瑞典）是基于沉降系數(shù)的差異來(lái)分離CTCs 的典型密度梯度離心方法。與Ficoll 相比，OncoQuick分離純度高，CTCs 捕獲率也有一定提升［16］。近年來(lái)，基于CTCs 大小原理的微流控芯片也被開發(fā)出來(lái)，被稱為“三維過(guò)濾”。Parsortix 系統(tǒng)是將微流控芯片構(gòu)建為3D 幾何形狀，并通過(guò)寬度逐漸減小的階梯樣結(jié)構(gòu)以捕獲CTCs 的技術(shù)平臺(tái)。該平臺(tái)對(duì)于不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞的捕獲率為42%～70%，且捕捉的CTCs 活性率達(dá)到了99%［17］。最近，Su 等［18］根據(jù)CTCs 與正常血細(xì)胞間大小與變形能力的差異，研發(fā)出一種新的集成微流控裝置用于CRC 患者外周血CTCs 的分離，結(jié)果顯示在3 小時(shí)內(nèi)所有晚期CRC 患者的外周血樣本中均成功捕獲到CTCs。

2 CTCs 在CRC 預(yù)后評(píng)估中臨床價(jià)值

CTCs 作為一種潛在微轉(zhuǎn)移灶，其在外周血中的存在與腫瘤患者的死亡結(jié)局密切相關(guān)［19］。有研究報(bào)道，對(duì)CTCs 數(shù)量及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)可預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后，與TNM 分期聯(lián)合應(yīng)用則可更精確地預(yù)測(cè)患者預(yù)后［20］。許多研究也表明，CTCs 對(duì)非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC 預(yù)后的評(píng)估均具有極高價(jià)值。對(duì)于非轉(zhuǎn)移性CRC，CTCs 可預(yù)測(cè)未來(lái)的轉(zhuǎn)移和較差的疾病預(yù)后；而在mCRC 患者樣本中鑒定出CTCs 則可能表明轉(zhuǎn)移病灶的形成［21］。Bork 等［22］研究發(fā)現(xiàn)CTCs 計(jì)數(shù)及手術(shù)前后CTCs 的動(dòng)態(tài)變化可預(yù)測(cè)非轉(zhuǎn)移性CRC 的預(yù)后，而術(shù)前CTCs 檢測(cè)更是非轉(zhuǎn)移性CRC 一個(gè)有力的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。在Cohen 等［11］針對(duì)430 例mCRC患者的研究中，≥3 個(gè)CTCs/7.5 mL 與PFS 和OS 縮短相關(guān)；而在化療治療5 周內(nèi)，基線CTCs 計(jì)數(shù)從≥3 轉(zhuǎn)變?yōu)?3 則與較長(zhǎng)的PFS 和OS 相關(guān)。另一研究則發(fā)現(xiàn)在基線CEA≥25 ng/mL 的患者中，基線CTCs<3 的患者OS 更長(zhǎng)；而在治療后CEA 降低相似的患者中，CTCs 水平不同的患者也表現(xiàn)出差異較大的預(yù)后［23］。這表明CTCs 與CEA 的聯(lián)合檢測(cè)可更精準(zhǔn)地評(píng)估預(yù)后。

CTCs 各亞型的預(yù)后價(jià)值也有所差異。有報(bào)道稱，上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal tran?sition，EMT）過(guò)程與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移緊密相連，導(dǎo)致上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，使基于EPCAM 的CTCs 檢測(cè)技術(shù)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［24］。Kozuka等［25］對(duì)mCRC 患者CTCs 樣本于單細(xì)胞水平進(jìn)行RNA 測(cè)序，結(jié)果顯示EMT 型CTCs 比上皮CTCs更常被檢測(cè)到，且與mCRC 患者的不良預(yù)后相關(guān)。CTCs 也可用于針對(duì)原發(fā)腫瘤病灶的基因檢測(cè)，進(jìn)而評(píng)估CRC 患者的預(yù)后。Denis 等［26］通過(guò)微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）對(duì)35 名CRC 患者的CTCs 樣本進(jìn)行KRAS基因狀態(tài)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs 與相應(yīng)腫瘤組織間的一致性為77%，敏感性為83%。這一數(shù)據(jù)表明，從CRC 患者的血液樣本中檢測(cè)CTCs 中KRAS 突變可用于預(yù)測(cè)原發(fā)腫瘤中的突變，從而改善患者預(yù)后。另有研究報(bào)道，侵襲性CTCs 大多表達(dá)CD133、CD44 和CD54+，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs 高表達(dá)意味著更短的生存期及更差的預(yù)后［27］。綜上，相關(guān)研究充分體現(xiàn)出CTCs 在結(jié)直腸癌中不同層面的預(yù)后價(jià)值。

3 CTCs 在CRC 療效評(píng)價(jià)中臨床價(jià)值

3.1 CTCs 在非轉(zhuǎn)移性CRC 中的療效評(píng)估

對(duì)于非轉(zhuǎn)移性CRC 患者，手術(shù)是行之有效的首選治療手段，術(shù)前檢測(cè)到的CTCs 正是影響癌癥進(jìn)展和生存的有效預(yù)后因素［28］；同時(shí)，手術(shù)操作也會(huì)影響外周血CTCs 數(shù)量。Wind 等［29］研究顯示，與術(shù)前相比，術(shù)中CTCs 的檢出率和數(shù)量顯著增加，且開腹手術(shù)檢測(cè)到的CTCs 明顯多于腹腔鏡手術(shù)。有報(bào)道顯示，接受原發(fā)腫瘤手術(shù)切除的CRC患者術(shù)后外周血中CTCs 數(shù)量會(huì)明顯減少，表明手術(shù)已發(fā)揮治療作用；反之，高CTCs 水平則表明術(shù)后的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加［30］，術(shù)后持續(xù)存在CTCs 也與患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（relapse?free survival，RFS）縮短和預(yù)后不良密切相關(guān)［31］。Yang 等［32］通過(guò)研究138 例行根治術(shù)CRC 患者的RFS，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs 陽(yáng)性是預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)，且與術(shù)前CTCs 陽(yáng)性無(wú)關(guān)。最近也有研究表明，當(dāng)非轉(zhuǎn)移性CRC 患者的術(shù)后CTCs<3 或術(shù)后CTCs 數(shù)量比術(shù)前CTCs 數(shù)量減少或持平時(shí)，表現(xiàn)為良好預(yù)后；反之則表現(xiàn)為不良預(yù)后［33］。綜上，CTCs 數(shù)量變化可反映非轉(zhuǎn)移性CRC 患者的手術(shù)治療效果，對(duì)手術(shù)療效作出評(píng)價(jià)。

3.2 CTCs 在mCRC 中的療效評(píng)估

據(jù)報(bào)道，約50%～60%的CRC 患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中80%～90%的患者患有不可切除的肝臟病變［34］。近年來(lái)，mCRC 的治療取得了顯著進(jìn)展，從OS 約11～12 個(gè)月發(fā)展到如今的平均OS 達(dá)到3年［35］。不過(guò)，mCRC 的高度異質(zhì)性依舊阻礙著靶向治療策略和個(gè)體化治療方案的優(yōu)選，臨床上需要預(yù)后標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)化療反應(yīng)，對(duì)mCRC 患者的化療療效進(jìn)行評(píng)價(jià)。Cohen 等［11］首次報(bào)道了CTCs 計(jì)數(shù)可作為患者預(yù)后的指標(biāo)以及評(píng)估m(xù)CRC患者化療療效的標(biāo)志物，目前已被FDA 批準(zhǔn)用于臨床實(shí)踐。此外也有報(bào)道稱，CTCs 是mCRC 患者PFS 和OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，也是一線治療有效性評(píng)估的關(guān)鍵因素［36］。

目前，CEA 是監(jiān)測(cè)mCRC 對(duì)全身治療反應(yīng)的首選標(biāo)志物。然而，S?rbye 等［37］的研究指出，在接受含奧沙利鉑化療治療的CRC 患者中盡管出現(xiàn)了客觀緩解，而CEA 水平卻一過(guò)性升高，這一現(xiàn)象說(shuō)明了CEA 作為療效評(píng)價(jià)標(biāo)志物的不穩(wěn)定 性。Satoshi 等［38］通過(guò)一項(xiàng)基于64 名接受奧沙利鉑治療的mCRC 患者的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，相較于CEA，CTCs 水平并未出現(xiàn)激增，表明在監(jiān)測(cè)mCRC 對(duì)全身治療的反應(yīng)方面，CTCs 是比CEA更有效的標(biāo)志物。由于CTCs 通過(guò)提前識(shí)別潛在轉(zhuǎn)移，確定患者對(duì)化療是否耐藥進(jìn)而評(píng)估化療療效，故在化療過(guò)程中，CTCs 持續(xù)存在提示腫瘤對(duì)化療不敏感，若檢測(cè)到CTCs 在化療過(guò)程中持續(xù)變化則提示腫瘤對(duì)化療敏感。Tan 等［39］通過(guò)研究mCRC 化療過(guò)程中CTCs 和CTCs 相關(guān)miRNAs 的變化情況，發(fā)現(xiàn)CTCs 與miRNA 聯(lián)合時(shí)可更好地反映療效及疾病進(jìn)展?fàn)顩r。此外，Javier 等［40］研究發(fā)現(xiàn)CTCs<3/7.5 mL 的KRAS野生型腫瘤患者的PFS 和OS 均高于CTCs>3/7.5 mL 的KRAS突變型腫瘤患者，CTCs 計(jì)數(shù)和KRAS狀態(tài)是接受貝伐單抗化療治療的mCRC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。這些研究表明，CTCs 與其它靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)在mCRC 患者療效評(píng)價(jià)方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

4 小結(jié)與展望

通過(guò)近些年研究的不斷深入，CTCs 檢測(cè)作為新型液體活檢技術(shù)已應(yīng)用于多種腫瘤領(lǐng)域，其相關(guān)技術(shù)在不斷進(jìn)步，應(yīng)用領(lǐng)域也在持續(xù)擴(kuò)大。與傳統(tǒng)影像學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查相比，CTCs 檢測(cè)具有微創(chuàng)、快速等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤性疾病的早期診斷、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估等方面都具有巨大潛能。但是，CTCs 的臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用依舊面臨著諸多挑戰(zhàn)，如檢測(cè)技術(shù)缺陷、檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性率與假陰性、缺乏關(guān)于CTCs 標(biāo)準(zhǔn)方面的共識(shí)等。在結(jié)直腸癌療效及預(yù)后評(píng)估方面，目前研究已表明CRC 患者外周血CTCs 數(shù)量與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，基于CTCs 水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)也是預(yù)后及療效評(píng)價(jià)有價(jià)值的臨床工具。將CTCs 與CEA等生物標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可多層面地提高CRC 患者療效評(píng)價(jià)的精確性。雖然目前還面臨著樣本量不夠大、檢測(cè)手段缺陷等導(dǎo)致的可靠性不足的問(wèn)題，但隨著本領(lǐng)域研究者的不斷拓展，如針對(duì)CRC 特性進(jìn)行多次多時(shí)間點(diǎn)CTCs 檢測(cè)、與多生物標(biāo)志物及基因位點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)等，CTCs 在結(jié)直腸癌患者治療及預(yù)后評(píng)價(jià)中的重要性將會(huì)充分得到體現(xiàn)。