結(jié)核病免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

盧珮

（崇左市人民醫(yī)院，廣西 崇左，532200）

結(jié)核病作為全球性公共健康問(wèn)題，截止至2020 年，全球新發(fā)結(jié)核病例數(shù)高達(dá)700 萬(wàn)例。成功診斷、治療可促使每年上百萬(wàn)結(jié)核病患者避免死亡，但最新數(shù)據(jù)顯示[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)2000～2020 年可避免5400 萬(wàn)人死亡。當(dāng)前對(duì)結(jié)核病檢出持續(xù)存在一定漏洞。目前結(jié)核分枝桿菌特異性抗原分析特點(diǎn)為簡(jiǎn)單、成本低、操作方便及測(cè)定快速等優(yōu)點(diǎn)，成為篩查結(jié)合病例有利方法，特別為中國(guó)、印度等資源受限國(guó)家[2]。目前對(duì)結(jié)核病診斷血清學(xué)研究領(lǐng)域中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找在結(jié)核病患者中能引起強(qiáng)烈抗體反應(yīng)潛在血清診斷抗原，而新型結(jié)核病免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)。文章就對(duì)近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外結(jié)核病免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面技術(shù)進(jìn)展如下分析，以促進(jìn)優(yōu)良實(shí)用的結(jié)核病診斷新技術(shù)在我國(guó)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）

TST 為一項(xiàng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)免疫試驗(yàn)。而結(jié)核菌素作為結(jié)核分枝桿菌代謝產(chǎn)物，可引起特異性反應(yīng)。包括舊結(jié)核菌素、純蛋白衍生物兩種。Koch 發(fā)明舊結(jié)核菌素，從結(jié)核菌培養(yǎng)基提取，含有結(jié)核蛋白外并包括培養(yǎng)基及菌體等成分[3]。純蛋白衍生物則是由Seibert 制備，包括結(jié)合蛋白，依據(jù)制取來(lái)源并分為數(shù)種。通過(guò)一定量PPD 經(jīng)皮注射至體內(nèi)，觀察局部皮膚紅腫硬結(jié)程度并判斷反應(yīng)強(qiáng)度[4]。當(dāng)前認(rèn)為T(mén)ST 對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病及潛伏性結(jié)核感染診斷價(jià)值高。同時(shí)，伴隨著現(xiàn)階段卡介苗接種范圍擴(kuò)大，上述試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性并非可直接確診為結(jié)核病，降低結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性率。研究指出[5]，結(jié)核菌素試驗(yàn)相比較其他檢測(cè)手段，陽(yáng)性率高達(dá)76.5%，靈敏度為88.2%，特異性低至34.4%，表明TST 具有較高假陽(yáng)性率。同時(shí)，種類(lèi)不同PPD 試驗(yàn)結(jié)果也存在著不同。但TST 低廉、方便及快速特點(diǎn)下，成為欠發(fā)達(dá)地區(qū)結(jié)核病檢測(cè)主要手段。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA 法）

ELISA 原理是指抗原或抗體吸附在特殊固相載體表面，吸附于載體上抗原或抗體會(huì)保留原有免疫活性，隨后添加樣本，并對(duì)樣本中受檢物質(zhì)與固相化物質(zhì)因特異性的抗原抗體反應(yīng)而相互結(jié)合。加入受檢物質(zhì)后并依據(jù)洗板除去非特異性結(jié)合物，添加既有酶活性又有免疫學(xué)活性酶標(biāo)記抗原及抗體。再次洗板并添加底物與酶反應(yīng)顯色后，利用酶標(biāo)儀讀取酶標(biāo)板孔中光密度值，依據(jù)光密度值并定性、定量分析。實(shí)驗(yàn)表明融合性的MPT64-Rv1985c 抗原可有效鑒別活動(dòng)性肺結(jié)核、潛伏感染者，ESAT-6 可區(qū)分BCG 接種者及結(jié)核菌感染者。同時(shí)上述方式應(yīng)用上有一定局限性，抗原抗體反應(yīng)時(shí)，會(huì)因個(gè)體差異、邊緣效應(yīng)、抗原本身濃度及PH 等因素對(duì)兩者結(jié)合效率造成影響。結(jié)核特異性抗原ELISA 檢測(cè)靈敏度為60%～85%，特異度為80%～95%[6]。敏感性范圍變化上，反應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)不穩(wěn)定性。快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確血清學(xué)免疫診斷方式應(yīng)用上受到臨床廣泛關(guān)注，可作為ELISA 發(fā)展指明方向。

3 斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾法（TB-DOT）

TB-DOT 原理是采取斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾技術(shù)并將提純的Mtb 特異性膜蛋白作為抗原，降低固定于硝酸纖維膜上，并將含有抗外膜蛋白抗體被檢血清標(biāo)本時(shí)，在毛細(xì)管層析作用下與特定抗原結(jié)合，加入吸附作用膠體金顆粒，依據(jù)反應(yīng)是否出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)判斷是否感染結(jié)核病[7]。當(dāng)前特異性膜蛋白應(yīng)用上包括MPB64、ESAT-6、14kD 等抗原。結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)中膠體金免疫層析法應(yīng)用期間具有顯著優(yōu)勢(shì)，如耗費(fèi)時(shí)間短、成本低以及操作簡(jiǎn)便等，被廣泛用于大樣本量篩查中，但仍然存在一定假陽(yáng)性、假陰性。報(bào)道提示[8]，對(duì)結(jié)核抗體檢測(cè)敏感性、特異性分析上為10%～90%、47%～100%，而不同研究上試劑、方法之間有一定差異性[9]。因此，上述檢測(cè)項(xiàng)目歸為一類(lèi)輔助診斷方式，配合痰細(xì)菌學(xué)、影像學(xué)及臨床表現(xiàn)等，可提高臨床結(jié)核病診斷率，協(xié)助應(yīng)用于早期診斷中，可指導(dǎo)患者擬定出合理治療方案，改善結(jié)核病患者預(yù)后。

4 結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）

T-SPOT.TB 定義：利用機(jī)體T 淋巴細(xì)胞并受到毒力的TBAg刺激后，活化分泌結(jié)核分枝桿菌特異性γ干擾素效應(yīng)T 細(xì)胞，并檢測(cè)、計(jì)數(shù)效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)量，用于評(píng)估機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌[10]。試驗(yàn)中，TBAg 可作為致病結(jié)核分枝桿菌RD1 區(qū)上Rv3874 編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10、Rv3875 編碼的早期分泌靶向抗原6。研究指出[11]，T-SPOT.TB 試驗(yàn)下，對(duì)378 例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者、824 例體檢健康者檢測(cè)結(jié)果得出，T-SPOT.TB結(jié)果下，陽(yáng)性診斷活動(dòng)性結(jié)核敏感性、特異性維持在91.0%、75.2%。對(duì)結(jié)果深度分析結(jié)果得出，依據(jù)TBAg/植物血凝素斑點(diǎn)數(shù)的比值并對(duì)活動(dòng)性結(jié)核、潛伏性結(jié)核感染區(qū)分，整體效果優(yōu)于T-SPOT.TB 斑點(diǎn)技術(shù)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果判斷，并對(duì)該項(xiàng)比值診斷肺外結(jié)核時(shí)有一定參考價(jià)值[12]。伴隨著近些年來(lái)T-SPOT.TB 不斷更新、應(yīng)用，新型T 細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（ELISPOT-IL-2 技術(shù)）廣泛應(yīng)用，基于T-SPOT.TB 基礎(chǔ)上，以原核表達(dá)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)PE36-p27 蛋白為刺激原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2，并通過(guò)固相載體上包被的抗人IL-2 單克隆抗體，后加入生物素標(biāo)記IL-2 單克隆抗體，分別結(jié)合后并添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，形成固相抗人IL-2 單克隆抗體-待測(cè)抗原-生物素標(biāo)記IL-2 單克隆抗體-HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物，洗滌后顯色，并對(duì)形成斑點(diǎn)觀察。伴隨著T-SPOT.TB 多種改進(jìn)技術(shù)在后期進(jìn)一步優(yōu)化，被用于結(jié)核病診療，上述新方法中仍需進(jìn)一步深入研究。

5 蛋白芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)定義：將不同目標(biāo)蛋白質(zhì)依據(jù)預(yù)先設(shè)置排列順序固定于各種載體表面，并做成微陣列檢測(cè)芯片，分析抗原抗體高度特異性結(jié)合特點(diǎn)，并對(duì)特定熒光物質(zhì)的針對(duì)芯片上蛋白質(zhì)TBAg 或抗體與檢測(cè)芯片反應(yīng)，洗滌并去除未與芯片上蛋白質(zhì)特異性結(jié)合熒光抗原、抗體后，利用激光共聚掃描技術(shù)、熒光掃描儀檢測(cè)芯片上各點(diǎn)熒光強(qiáng)度，依據(jù)熒光強(qiáng)度，并分析各種待測(cè)樣本中蛋白質(zhì)。目前蛋白質(zhì)芯片被用于尋找新藥作用靶點(diǎn)、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)及科研等方面[13]。研究指出[14]，蛋白質(zhì)芯片篩選腦脊液120 種細(xì)胞因子，并檢測(cè)83 種細(xì)胞因子，分析62 例患者腦脊液因子含量，可得出γ-干擾素、白介素-8 及單核細(xì)胞趨化蛋白-2 作為結(jié)核性腦膜炎診斷性細(xì)胞因子。研究指出[15]，蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)420 例結(jié)核病患者血液標(biāo)本，結(jié)果顯示，涂陽(yáng)肺結(jié)核陽(yáng)性率76.15%，結(jié)核蛋白質(zhì)芯片固定TBAg 蛋白16000、38000、結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞壁脂多糖抗原三抗體聯(lián)合檢測(cè)下，結(jié)核病陽(yáng)性率、診斷準(zhǔn)確率顯著提升，被用于結(jié)核病診斷中有一定輔助價(jià)值。但近些年來(lái)結(jié)核蛋白質(zhì)芯片法作為一類(lèi)新型研究方式，對(duì)臨床診斷、療效評(píng)估及科學(xué)研究仍需進(jìn)一步分析。

結(jié)核病免疫學(xué)檢測(cè)手段日趨豐富，多種免疫檢測(cè)方式應(yīng)用及聯(lián)合成為結(jié)核病診斷新趨勢(shì)。但目前臨床應(yīng)用有一定局限性，精確、可靠及快速及低廉檢測(cè)手段仍需探索設(shè)計(jì)。同時(shí)，部分免疫學(xué)檢測(cè)仍需臨床大規(guī)模探索驗(yàn)證，才能不斷改良及完善。盡管針對(duì)結(jié)核病免疫學(xué)檢測(cè)發(fā)展過(guò)程中仍然面臨挑戰(zhàn)，但伴隨著結(jié)核病免疫學(xué)機(jī)制研究及生物學(xué)發(fā)展不斷深入，結(jié)核病免疫檢測(cè)被廣泛應(yīng)用，對(duì)結(jié)核病早診斷、早干預(yù)及早治療具有重要意義。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)核病免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)結(jié)核病防治意義深遠(yuǎn)，同時(shí)仍需科學(xué)家發(fā)現(xiàn)更加有效檢測(cè)方法。