巢湖藍(lán)藻酸性多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化作用

李志平，張弛，周維清，紀(jì)啟芳，孔小衛(wèi)，李玉成，*

（1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥230601；2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230601）

巢湖藍(lán)藻酸性多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化作用

李志平1，張弛2，周維清2，紀(jì)啟芳2，孔小衛(wèi)2，李玉成1，*

（1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥230601；2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230601）

目的：以從巢湖藍(lán)藻中分離純化的一種多糖（acidic polysaccharide from Cyanobacteria of Chaohu，CHAP）為研究對(duì)象，對(duì)其純度、分子質(zhì)量、光譜特征、單糖組成、抗氧化作用進(jìn)行研究，旨在為水華藍(lán)藻資源進(jìn)行綜合開發(fā)利用提供有價(jià)值的參考。方法：采用60℃的熱水抽提藍(lán)藻，采用硫酸銨去除其中蛋白質(zhì)，粗多糖經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析柱分離并用Sephadex G-150進(jìn)行純化得到純化多糖CHAP。結(jié)果：CHAP中多糖和蛋白質(zhì)含量分別為91.49%和0.18%，紫外-可見光譜表明CHAP不含核酸，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定CHAP的分子質(zhì)量為2.209×105D，離子色譜（ion chromatography，IC）表明CHAP由6.36%的阿拉伯糖、35.47%的葡萄糖、5.03%的木糖、17.09%的半乳糖、27.36%的甘露糖及一種未知單糖構(gòu)成。紅外光譜表明CHAP是具有α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰的吡喃糖，CHAP的抗氧化作用表明：CHAP對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基（O2-·）有較強(qiáng)的清除能力，其IC50分別為276μg/mL和186.05μg/mL。CHAP對(duì)羥自由基（·OH）的清除能力較弱，清除率不到10%。

巢湖藍(lán)藻；酸性多糖；理化性質(zhì)；抗氧化作用

由于巢湖的富營(yíng)養(yǎng)化，巢湖每年都會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的藍(lán)藻水華，微囊藻是形成巢湖藍(lán)藻水華的主要種類之一［1］。目前，直接打撈藍(lán)藻仍是湖泊富營(yíng)養(yǎng)化治理的長(zhǎng)期基本措施［2］。但是打撈上來(lái)的藍(lán)藻由于含有藻毒素不能被家禽、家畜直接利用而被隨意堆放在岸邊，此法不但直接占用大量的土地，而且藻體在死亡衰敗過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)往往會(huì)對(duì)周邊的環(huán)境造成污染［3］。

近年來(lái)，藍(lán)藻資源化成為了研究熱點(diǎn)之一，許玲等［4］系統(tǒng)介紹了藍(lán)藻在能源化利用、提取天然色素、提取藻膽蛋白、提取多糖、生物固氮及其他方面的利用情況，為藍(lán)藻的綜合利用提供了有價(jià)值的參考。藍(lán)藻體內(nèi)、細(xì)胞壁以及由鞘、莢膜、黏質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞外層都含有豐富的多糖組成［5］，大量研究表明：多糖是一類具有生理生化活性的大分子物質(zhì)，而且具有抗腫瘤、抗炎癥、提高機(jī)體免疫力和降低血糖等生物活性［6］。任欣欣等［7］研究發(fā)現(xiàn)：藍(lán)藻胞外多糖是一種酸性雜多糖，超過(guò)75%的多糖由6種以上單糖組成。胞外多糖具有一系列重要的生理生化功能，而且在生態(tài)學(xué)和工業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。王習(xí)達(dá)等［8］用熱水浸提法提取、DEAE-52纖維素柱分離純化得到銅綠微囊藻酸性多糖，研究表明銅綠微囊藻酸性多糖是一種新型的α-型吡喃糖，平均分子質(zhì)量為2.0028×105D，由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成。梅秋紅等［9］采用pH8.0、80℃的熱水抽提銅綠微囊藻，得到兩種胞外多糖，兩種胞外多糖的單糖組成一致，但分子質(zhì)量不同。這些研究取得了較高的水平，也為當(dāng)前的研究提供了很好的基礎(chǔ)，但他們往往以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的藍(lán)藻為研究對(duì)象，對(duì)野外采集的藍(lán)藻的直接研究較少，在理化性質(zhì)以及活性方面的研究也不足。本實(shí)驗(yàn)以巢湖藍(lán)藻為直接提取原料，并對(duì)藍(lán)藻酸性多糖（acidic polysaccharide from Cyanobacteria of Chaohu，CHAP）進(jìn)行分離純化，研究其理化性質(zhì)，探討其體外抗氧化能力，旨在充分利用巢湖藍(lán)藻這一大量生物資源，為下一步藍(lán)藻多糖在生物活性和藥理藥效等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

2013年7月20日巢湖西半湖塘西河口采集藍(lán)藻，經(jīng)鏡檢98%以上為藍(lán)藻門的微囊藻屬，經(jīng)測(cè)定藻漿的含水率為95.85%。

標(biāo)準(zhǔn)單糖葡萄糖（D-glucose，Glc）、半乳糖（D-galactose，Gal）、阿拉伯糖（L-arabinose，Ara）、鼠李糖（L-rhamnose，Rha）、甘露糖（D-mannose，Man）、木糖（D-xylose，Xyl）、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-100、T-500、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Tris美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DEAE-52陰離子交換層析柱英國(guó)Whatman公司；UV-2100分光光度計(jì)瑞典Pharmacia Biotech公司；4100型紫外-可見光-近紅外分光光度計(jì)日本日立公司；紅外光譜分析儀美國(guó)Sigma公司；Waters515高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；ICS-3000型色譜儀美國(guó)戴安公司。

1.3方法

1.3.1多糖提取與純化

粗多糖的提?。悍Q取一定量藻漿，反復(fù)凍融3次后按1∶30料液比加入蒸餾水混勻，60℃水浴4h，離心取上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/10，加5倍體積無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，離心、收集沉淀，加一定量蒸餾水溶解，加固體硫酸銨直至不再溶解為止，離心取上清液，再用透析袋自來(lái)水流水透析3d，蒸餾水透析1d，濃縮、冷凍干燥得粗多糖。

藍(lán)藻酸性多糖的分離：取一定量粗多糖，溶于適當(dāng)蒸餾水中。過(guò)DEAE-52陰離子交換層析柱，先用蒸餾水洗脫（流速：1.5mL/min，6mL/管），苯酚-硫酸法檢測(cè)直至無(wú)糖檢測(cè)出來(lái)為止。然后用1mol/L的NaCl溶液洗脫（流速：1.5mL/min，6mL/管），苯酚-硫酸法檢測(cè)直至無(wú)糖出來(lái)為止。收集合并主峰，鹽洗部分自來(lái)水流水和蒸餾水各透析1d，旋轉(zhuǎn)濃縮、冷凍干燥得酸性藍(lán)藻多糖。

藍(lán)藻酸性多糖的純化：取20mg酸性藍(lán)藻多糖溶于2mL去離子水中，Sephadex G-150層析，以蒸餾水洗脫，流速0.5mL/min，每管2mL。苯酚-硫酸法［10］跟蹤測(cè)定多糖并繪制洗脫曲線。收集主峰、冷凍干燥得到藍(lán)藻多糖CHAP。

1.3.2CHAP基本理化性質(zhì)測(cè)定

檢驗(yàn)CHAP在水、乙醇、氯仿等溶劑中的溶解度，并進(jìn)行斐林試劑反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)。

1.3.3CHAP糖含量和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

分別采用苯酚-硫酸法［10］和考馬斯亮藍(lán)法［11］測(cè)定糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.4CHAP紫外-可見光譜分析

將CHAP用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的多糖溶液，用去離子水為空白對(duì)照調(diào)零，在190～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。取配制好的多糖溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液、濃硫酸以1∶2∶5的體積比顯色，混勻靜置10min后在400～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.5CHAP紅外光譜分析

取少量干燥的CHAP與KBr充分研磨制片，然后在4000～500cm-1范圍內(nèi)掃描，測(cè)定其紅外吸收。

1.3.6CHAP分子質(zhì)量測(cè)定［12］

分別稱取10mg的CHAP及多糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-100、Dextran T-500、Dextran T-2000分別溶于2mL蒸餾水中，過(guò)0.22μm的水膜。分析儀器為高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，分析柱為TSK-GELG4000PWX，柱溫37℃，流動(dòng)相為乙腈-水（4∶1，V/V），流動(dòng)相速率為1.0mL/min，上樣量為10μL。分別記錄各自的色譜圖，用分析軟件以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值（lgMW）對(duì)保留時(shí)間tR進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程lgMw= 17.928-1.8712t（R2=0.9932），按照回歸方程求出CHAP分子質(zhì)量。

1.3.7CHAP單糖組成分析

多糖的水解：精密稱取CHAP樣品25.0mg于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液3mL，充N2后封口，置于110℃烘箱中加熱水解8h，取出70℃旋轉(zhuǎn)濃縮至干，得多糖水解物。取水解物配制成20mg/L的藍(lán)藻水解單糖溶液。

CHAP的離子色譜分析［13］：分別用去離子水稀釋成質(zhì)量濃度為1.0mg/L的鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再配制質(zhì)量濃度均為1.0mg/L的上述6種糖的混標(biāo)溶液。儀器參數(shù)：分析儀器為ICS-3000型色譜儀，檢測(cè)器為電化學(xué)檢測(cè)器ED50（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極），掃描電位為脈沖安培電位波形，分析柱為CarboPac PA200（3mm×250mm）。流動(dòng)相為2.5mmol/L的NaOH，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。

1.3.8CHAP體外抗氧化研究

1.3.8.1對(duì)DPPH自由基的清除作用測(cè)定

DPPH乙醇溶液呈紫色，在517nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈吸收。加入抗氧化劑后，顏色變淺，溶液吸光度下降，以在517nm波長(zhǎng)處吸光度的下降值表示抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力［14-15］。

參考Shimada等［16］的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取0.002g DPPH溶于無(wú)水乙醇，50mL棕色容量瓶定容。取11支具塞試管（10mL），樣品組試管加入2mL DPPH和2mL一定質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液，混合均勻后，黑暗中反應(yīng)30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。同時(shí)測(cè)定抗壞血酸清除DPPH自由基能力，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：A1為2mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+ 2mL DPPH溶液即樣品組吸光度；A2為2mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+2mL無(wú)水乙醇即樣品組本身吸光度；A0為2mL去離子水+2mL DPPH溶液即空白組吸光度。

1.3.8.2對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用測(cè)定

利用Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生·OH?！H氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，吸光度大小與·OH呈正比。在體系中加入含羥基的受試物，受試物上的羥基與Fe2+絡(luò)合，從而阻斷·OH的生成途徑［17］。

參考張?jiān)苽b［12］的方法并略作修改。取11支10mL具塞試管，各加9mmol/L的FeS04溶液1mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，樣品組加入一定質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液2mL，然后加入8.8mmol/L的H2O2溶液2mL啟動(dòng)反應(yīng)，室溫下反應(yīng)1h，在510nm波長(zhǎng)出測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)測(cè)定抗壞血酸清除·OH能力?！H清除率計(jì)算公式如下：式中：A1為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+2mL H2O2溶液即樣品組吸光度；A2為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+2mL H2O即樣品組本身吸光度；A0為1mL FeSO4溶液+2mL水楊酸-乙醇溶液+ 2mL H2O+2mL H2O2即空白對(duì)照吸光度。

O2-·加速鄰苯三酚的自養(yǎng)化速率并生成有色中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物在320nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的光吸收。如加入產(chǎn)生抑制劑，便能抑制O2-·和有色物質(zhì)的產(chǎn)生，通過(guò)測(cè)定吸光度的差異就可判斷出抑制劑的抑制效果［18］。

參考張?jiān)苽b［12］的方法，并略作修改。取l0mL具塞試管11支，加入5mL濃度為0.05mol/L、pH8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，加入1mL一定質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL）的多糖溶液，25℃反應(yīng)20min后，加入3mmol/L的鄰苯三酚0.4mL，混合均勻，25℃準(zhǔn)確反應(yīng)4min后，立即用0.5mL的濃鹽酸終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次，同時(shí)測(cè)定抗壞血酸清除能力。清除率計(jì)算公式如下。

式中：A1為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+0.4mL鄰苯三酚溶液+0.5mL濃鹽酸即樣品組吸光度；A2為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液+0.4mL超純水+0.5mL濃鹽酸即樣品組本身吸光度；A0為5mL的Tris-HCl緩沖液+1mL超純水+0.4mL鄰苯三酚溶液+0.5mL濃鹽酸即空白對(duì)照吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1多糖的提取與純化

圖1　巢湖藍(lán)藻酸性多糖在Sephadex G-150柱上的洗脫曲線Fig.1Elution curve of acidic polysaccharide extracted from Cyanobacteria on Sephadex G-150column

由圖1可知，酸性多糖經(jīng)Sephadex G-150層析，可以較好地分離兩種多糖，收集后面主峰得到純化多糖（CHAP）。

2.2CHAP理化性質(zhì)

實(shí)驗(yàn)得到的CHAP為淺棕色疏松絮狀物，易溶于水，不溶于高濃度乙醇及氯仿等有機(jī)試劑。碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說(shuō)明CHAP不是淀粉類多糖。CHAP與斐林試劑和三氯化鐵反應(yīng)為陰性，說(shuō)明CHAP不含單糖和多酚類物質(zhì)。硫酸-咔唑反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明CHAP含有糖醛酸。

2.3CHAP糖含量和蛋白質(zhì)含量分析

經(jīng)測(cè)定CHAP中糖與蛋白質(zhì)含量分別為91.49%和0.18%。

2.4CHAP紫外-可見光譜分析

圖2CHAP紫外-可見光圖譜Fig.2Ultraviolet spectrum of CHAP in the wavelength rang of190-900nm

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜的主要原因是色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)光的吸收，其次是苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）殘基的側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)光的吸收。Trp和Tyr在280nm波長(zhǎng)附近有吸收峰，Phe在257nm波長(zhǎng)附近有吸收峰［19］。由圖2可知，CHAP在250～280nm波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收峰，說(shuō)明CHAP殘留的蛋白質(zhì)中不含上述氨基酸，同時(shí)也說(shuō)明CHAP不含核酸。由圖3可知，CHAP經(jīng)苯酚-硫酸顯色反應(yīng)后，在490nm波長(zhǎng)處有多糖的特征吸收峰。

圖3CHAP經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后紫外-可見光圖譜Fig.3UV-visible spectrum of CHAP reacted with phenol and sulfate in the wavelength range of400-900nm

2.5CHAP紅外光譜分析

圖4CHAPP紅外光譜Fig.4IR spectrum of CHAP

由圖4可知，CHAP在3000～2800cm-1、1400～1200cm-1兩組范圍內(nèi)均有吸收峰，它們屬于糖類的特殊吸收峰，前峰是糖類中—CH2中C—H伸縮振動(dòng)，后峰是C—H變角振動(dòng)。在3392cm-1處有一寬峰，代表是多糖中分子間氫鍵O—H引起伸縮振動(dòng)。1652cm-1處的吸收峰是羰基中的C=O伸縮振動(dòng)引起的。1411cm-1處的吸收峰則是—COOH中C—O伸縮振動(dòng)引起的。1035cm-1處的強(qiáng)吸收峰則是吡喃糖環(huán)的C—O—C振動(dòng)引起。894cm-1處的特征峰代表了吡喃環(huán)的β端基差向異構(gòu)的C—H變角振動(dòng)。在815cm-1處的吸收峰是α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰［20］。

2.6CHAP的分子質(zhì)量

圖5CHAP的HPLC圖HPLCFig.5HPLC of CHAP

由HPLC檢測(cè)得到藍(lán)藻多糖CHAP基本為單一對(duì)稱峰（圖5），說(shuō)明CHAP純度較高。根據(jù)CHAP的出峰時(shí)間，計(jì)算出CHAP的分子質(zhì)量為2.209×105D。

2.7CHAP單糖組成分析

離子色譜法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的色譜分析方法，可通過(guò)將糖類物質(zhì)在強(qiáng)堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離，然后通過(guò)金電極脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到分析糖類物質(zhì)的目的［21-22］，該法不需要預(yù)先衍生就能檢測(cè)到幾乎所有的單糖，且靈敏度高，分析速度快，穩(wěn)定性較好。

圖6標(biāo)準(zhǔn)單糖離子色譜圖Fig.6Ion chromatogram of monosaccharide standards

圖7CHAP水解樣品離子色譜圖Fig.7Ion chromatogram of CHAP

圖6是標(biāo)準(zhǔn)單糖為L(zhǎng)-鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖的標(biāo)準(zhǔn)混合色譜圖。由圖7可知，CHAP的單糖組成是L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖，說(shuō)明CHAP是一種雜多糖。經(jīng)計(jì)算各單糖百分含量分別為6.36%、17.09%、35.47%、5.03%、27.36%。圖7中位于半乳糖和葡萄糖之間的糖由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照，不能鑒定。

2.8藍(lán)藻多糖體外抗氧化研究

2.8.1DPPH自由基清除能力

對(duì)DPPH自由基的清除能力可以用來(lái)衡量抗氧化劑的抗氧化活性，清除率越高，抗氧化能力越強(qiáng)。自由基清除劑對(duì)DPPH自由基的清除程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，也就是說(shuō)和抗氧化劑的供氫能力有關(guān)［23］。

圖8藍(lán)藻多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除作用的比較Fig.8Comparison of DPPH free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

由圖8可知，VC對(duì)DPPH自由基有很強(qiáng)的清除作用，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)清除率就接近于100%。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力隨著CHAP質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，但當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到400μg/mL后對(duì)DPPH自由基清除能力基本保持不變，最高為60.71%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求得藍(lán)藻多糖對(duì)DPPH自由基清除IC50為276μg/mL。VC和CHAP對(duì)DPPH自由基清除能力的差異可能與羥基的數(shù)目和活性相關(guān)［24］。

2.8.2·OH清除能力

·OH是生物體內(nèi)正常代謝產(chǎn)物，在正常情況下，機(jī)體處于動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被打破，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，從而引起一系列疾?。?5］。因此，以對(duì)·OH清除率為評(píng)價(jià)多糖的抗氧化能力具有重要的意義。VC為已知的·OH清除劑，因此以VC為對(duì)照品與CHAP進(jìn)行比較，結(jié)果見圖9。VC對(duì)·OH的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的升高而升高，CHAP對(duì)·OH的清除能力較弱，隨著其質(zhì)量濃度的變化，清除率無(wú)顯著變化，基本維持在7%左右?？赡苁怯捎贑HAP上的羥基與Fe2+絡(luò)合能力較弱，相關(guān)的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

圖9藍(lán)藻多糖和VC對(duì)VC·OH清除作用的比較Fig.9Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

圖1　0藍(lán)藻多糖和VC對(duì)VC清除作用的比較Fig.10Comparison of superoxide anion free radical scavenging capacity between CHAP and vitamin C

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討論

由于巢湖水體的富營(yíng)養(yǎng)化沒有根本的改善，每年夏秋季節(jié)由于巢湖的富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的水華爆發(fā)對(duì)巢湖周邊的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的災(zāi)難。而打撈上來(lái)的大量藍(lán)藻如何有效地利用和處理是目前亟需解決的問題。本實(shí)驗(yàn)以直接打撈的藍(lán)藻為原材料，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融去除細(xì)胞壁［27］，水浴法得到藍(lán)藻多糖粗提物。多糖粗提物經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀，在蛋白質(zhì)沉淀的同時(shí)一部分溶解性小的多糖也沉淀下來(lái)［28］，這相對(duì)于經(jīng)典的蛋白去除方法Sevag法有處理量大、操作簡(jiǎn)便、不產(chǎn)生有害物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，而且多糖可以得到進(jìn)一步純化。粗多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52吸附NaCl洗脫得到酸性多糖，得到的酸性多糖再經(jīng)過(guò)Sephadex G-150純化得到相對(duì)均一性多糖CHAP。

從單糖組成上來(lái)看，CHAP是酸性雜多糖，這與滇池水華藍(lán)藻酸性多糖［29］、太湖水華藍(lán)藻酸性多糖［30］研究結(jié)論一致。這3種水華藍(lán)藻多糖單糖組成中都含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，但單糖組成種類不完全一樣，可能是由于各自不同的環(huán)境條件和提取條件導(dǎo)致的。這3種水華藍(lán)藻多糖與從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的藍(lán)藻中提取的酸性多糖［8-9，31］在單糖組成上也不同，而且前者的單糖組成種類明顯多于后者。從分子質(zhì)量上來(lái)看，CHAP的分子質(zhì)量（2.209×105D）與銅綠微囊藻的胞內(nèi)多糖分子質(zhì)量［31］（2.0025×105D）接近，可能是由于胞外多糖的分子質(zhì)量（7.0012×104D）相對(duì)較小，在硫酸銨沉淀環(huán)節(jié)與蛋白質(zhì)一起被沉淀下來(lái)。初步抗氧化研究表明CHAP對(duì)

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Physico-chemical Characteristics and Antioxidant Activity of Acidic Polysaccharide Extracted from Cyanobacteria from Chaohu Lake

LI Zhiping1，ZHANG Chi2，ZHOU Weiqing2，JI Qifang2，KONG Xiaowei2，LI Yucheng1，*
（1.College of Resources and Environmental Engineering，Anhui University，Hefei230601，China；2.College of Life Science，Anhui University，Hefei230601，China）

Objective：To the study physico-chemical characteristics and antioxidant activities of acidic polysaccharide extracted from Cyanobacteria from the Chaohu Lake.Methods：Acidic polysaccharide was extracted by hot water（60℃）from Cyanobacteria.After deproteinization by ammonium sulfate method，the neutral and acidic polysaccharides were pooled from the elutes of DEAE-52gel column.Then，the acidic polysaccharides were further loaded onto Sephadex G-150column and a purified acidic polysaccharide，CHAP，was obtained.HPLC，UV，IR，and IC were used for the analysis of CHAP for purity，molecular weight，monosaccharide composition，spectroscopic characteristics and antioxidant activity.Results：The CHAP obtained contained91.49%polysaccharides and0.18%proteins without the presence of nucleic acids.The mean molecular weight of CHAP was2.209×105D.The monosaccharide composition of CHAP included L-arabinose（6.36%），glucose（35.47%），D （+）xylose（5.03%），D-mannose（27.36%），D-galactose（17.09%），and unknown monosaccharides.Infrared spectrum showed that CHAP was mainly composed of pyranose-polysaccharides and had a characteristic absorption peak ofα-D-galactopyranosyl.The results of antioxidant activity indicated that CHAP had a strong ability to scavenge both superoxide anion free radicals and DPPH free radicals，with IC50values of186.05and276μg/mL，respectively.However，almost no scavenging effect against hydroxyl free radical was observed.

Cyanobacteria from the Chaohu Lake；acidic polysaccharide；physico-chemical characteristics；antioxidant activity

TS244.5

A

1002-6630（2015）05-0007-06

10.7506/spkx1002-6630-201505002

2014-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（40972092；41172121）；巢湖入湖重污染河道污染消減關(guān)鍵技術(shù)與示范工程項(xiàng)目（2012ZX07103-004）

李志平（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗廴究刂?。E-mail：li_zhi_ping@yeah.net

李玉成（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锏厍蚧瘜W(xué)。E-mail：li-yucheng@163.com