超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝研究

張潤紅　謝簡珺　趙　麗

超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝研究

張潤紅謝簡珺趙麗

（蘭州石化職業(yè)技術(shù)大學(xué)甘肅蘭州730000）

為尋求一種以水為溶劑高效提取核桃青皮總黃酮的最優(yōu)工藝，以便后續(xù)核桃青皮堆肥歸田還林，實驗采用超聲波輔助復(fù)合酶提取核桃青皮總黃酮進(jìn)行研究。首先通過單因素實驗分析了復(fù)合酶配比、浸取溫度、料液比、浸取時間和浸取液pH等因素對核桃青皮總黃酮提取率的影響，然后利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件，最后通過三組平行實驗驗證優(yōu)化結(jié)果。實驗表明：在功率為100 W的超聲環(huán)境中，當(dāng)復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為55 ℃，液料比（g/mL）為1∶35，浸取時間為30 min，浸取液pH為6時，總黃酮提取率最高，約為7.53％。

核桃青皮；超聲波；復(fù)合酶；總黃酮；提取工藝

核桃青皮又稱青龍衣，為核桃外部一層厚厚的綠色果皮，是核桃最主要的副產(chǎn)品。在核桃加工場所，會產(chǎn)生2倍以上干核桃的核桃青皮，數(shù)量較大。充分利用核桃青皮資源不但可以成為核桃產(chǎn)業(yè)新的經(jīng)濟(jì)增長點，還可以減少由于核桃青皮不合理處置產(chǎn)生的環(huán)境污染。目前，最理想的核桃青皮利用方式是先提取核桃青皮中的單寧、黃酮類、多酚類和萘醌等活性物質(zhì)，然后將核桃青皮堆肥歸田還林[1-3]。

黃酮類化合物是核桃青皮的次生代謝產(chǎn)物之一，具有抗氧化、抑菌、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨質(zhì)疏松、預(yù)防老年癡呆和腦出血等多種作用，利用價值較高[4-5]。本實驗同時利用超聲波產(chǎn)生的振蕩力和高速、劇烈的空化效應(yīng)以及生物酶解技術(shù)的破壁作用，加速細(xì)胞內(nèi)成分的溶解、擴(kuò)散，從而提取核桃青皮總黃酮[6]。首先考察復(fù)合酶配比、料液比、浸取溫度、浸取液pH、浸取時間等單因素對總黃酮提取率的影響，然后選取對實驗影響較大的三個因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化分析，最終確定出最優(yōu)提取工藝，為提取核桃青皮總黃酮提供科學(xué)依據(jù)。

1 超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮實驗

1.1 材料與儀器

核桃青皮，產(chǎn)于甘肅慶陽；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98％）、果膠酶（酶活力500 U/mg）、纖維素酶（酶活力50 U/mg），均購于上海源葉生物科技有限公司；NaOH、無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3，均為分析純試劑。

AB-204-N型分析天平，瑞士Mettler公司；PHS-4C+酸度計，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；H1850型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KQ2200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1801型紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃青皮的預(yù)處理

將新鮮的核桃青皮洗凈后曬干[7]，去除雜質(zhì)，粉碎，過40目篩，室溫下儲存于干燥器中備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品6 mg，用80％的乙醇溶液溶解后定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.06 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用80％的乙醇溶液定容，混勻顯色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm處測定溶液的吸光值A(chǔ)。以溶液的吸光值A(chǔ)對蘆丁的質(zhì)量濃度作圖，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程[8-10]。

1.2.3 總黃酮的提取及含量測定

準(zhǔn)確稱取核桃青皮粉末1.0 g、復(fù)合酶（纖維素酶＋果膠酶）0.04 g于100 mL圓底燒瓶中，置于功率為100 W的超聲環(huán)境中分別在不同的復(fù)合酶配比、料液比、浸取溫度、浸取液pH、浸取時間條件下用水浸取核桃青皮總黃酮，待浸取液冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容備用。取一定量浸取液至離心杯中，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液3 mL于50 mL容量瓶中，依次加入2.0 mL 5％的NaNO2溶液，搖勻靜置6 min，再加入2.0 mL 10％的Al(NO3)3溶液，靜置6 min，再加入20.0 mL 5％的NaOH溶液，用水定容，混勻顯色15 min，最后使用1 cm比色皿于510 nm處測定溶液的吸光值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參照，計算核桃青皮總黃酮含量，并按如式（1）求出總黃酮的提取率。

式（1）中：為浸取液中總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；為浸取液體積（mL）；為浸取液稀釋倍數(shù)；為稱取的核桃青皮粉末的質(zhì)量（g）；為總黃酮提取率（％）。

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

（1）復(fù)合酶配比對總黃酮提取率的影響

在浸取溫度為50 ℃，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）分別為0∶0、1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1的條件下，考察復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）對總黃酮提取率的影響。

（2）浸取溫度對總黃酮提取率的影響

在復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，浸取溫度分別為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的條件下，考察浸取溫度對總黃酮提取率的影響。

（3）浸取時間對總黃酮提取率的影響

在復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，料液比（g/mL）為1∶30，浸取液pH為5.0，浸取時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min的條件下，考察浸取時間對總黃酮提取率的影響。

（4）料液比對總黃酮提取率的影響

在復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，浸取液pH為5.0，浸取時間為50 min，料液比（g/mL）分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的條件下，考察料液比（g/mL）對總黃酮提取率的影響。

（5）浸取液pH對總黃酮提取率的影響

在復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為50 ℃，料液比（g/mL）為1∶30，浸取時間為50 min，浸取液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的條件下，考察浸取液pH對總黃酮提取率的影響。

2 總黃酮提取實驗結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以吸光度為因變量，蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為自變量，得到線性回歸方程為=11.589－7×10-6，相關(guān)系數(shù)2=1，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 復(fù)合酶配比的影響結(jié)果

不同復(fù)合酶配比下的總黃酮提取率如圖2所示，可知在其他條件不變時，加入復(fù)合酶后核桃青皮總黃酮提取率顯著提高，說明加入復(fù)合酶有助于總黃酮的溶出。其中，當(dāng)復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1時，總黃酮提取率達(dá)到最大，這可能與核桃青皮的細(xì)胞壁組成和纖維素酶、果膠酶的酶活力不同有關(guān)。

圖2　不同復(fù)合酶配比下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.2 浸取溫度的影響結(jié)果

不同浸取溫度下的核桃青皮總黃酮提取率如圖3所示，可知在其他條件一定時，總黃酮提取率隨著浸取溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在55 ℃時達(dá)到峰值。原因可能是，隨著溫度的升高，復(fù)合酶的活性逐漸增強(qiáng)，在55 ℃時活性最強(qiáng)，而當(dāng)溫度超過55 ℃后復(fù)合酶逐漸失活，導(dǎo)致總黃酮提取率降低[11-12]。

圖3　不同浸取溫度下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.3 浸取時間的影響結(jié)果

不同浸取時間下的核桃青皮總黃酮提取率如圖4所示，可知在其他條件一定時，總黃酮提取率隨浸取時間的增加整體呈先升后降的趨勢，當(dāng)浸取時間為30 min時，總黃酮提取率達(dá)到最大值。原因可能是，隨著時間的延長，超聲波的空化、振蕩作用和復(fù)合酶的破壁作用結(jié)合，不僅使核桃青皮組織細(xì)胞破碎程度增加，也使黃酮類物質(zhì)的損失增加，從而降低了總黃酮的提取率。

圖4　不同浸取時間下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.4 料液比的影響結(jié)果

不同料液比下的核桃青皮總黃酮提取率如圖5所示，可知在其他條件一定時，核桃青皮總黃酮的提取率隨液料比（g/mL）的增加呈先升后降的趨勢，在液料比（g/mL）為1∶35時達(dá)到最大值?？赡茉蚴?，浸取液較少時，核桃青皮粉末與浸取液的接觸面有限，總黃酮溶出效果欠佳。隨著溶劑量的增加，核桃青皮粉末與浸取液的接觸面積增大，浸取更充分，進(jìn)而核桃青皮總黃酮溶出率升高。當(dāng)料液比（g/mL）超過1∶35，繼續(xù)增加浸取液的量對總黃酮的溶出發(fā)揮作用開始受限，而與黃酮類物質(zhì)存在拮抗作用的色素等其他雜質(zhì)的溶出率開始上升，反而影響了總黃酮的提取效果[13]。

圖5　不同料液比下的核桃青皮總黃酮提取率

2.2.5 浸取液pH的影響結(jié)果

不同浸取液pH下的核桃青皮總黃酮提取率如圖6所示，可知在其他條件一定時，浸取液pH對總黃酮提取率的影響波動較大，其中在pH=6.0時，總黃酮提取率達(dá)到最大值。其主要原因是，復(fù)合酶由果膠酶和纖維素酶兩種酶組成，而這兩種酶的最適pH不一致，所以在不同的pH條件下各自發(fā)揮的作用存在差異。當(dāng)pH=6.0時，兩種酶的協(xié)同作用最強(qiáng)。當(dāng)pH超過6.0時，復(fù)合酶開始出現(xiàn)失活，致使總黃酮提取率開始下降。

圖6　不同浸取液pH下的核桃青皮總黃酮提取率

3 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝實驗

3.1 響應(yīng)面法實驗因素設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對核桃青皮總黃酮提取率影響較大的三個因素為自變量，即浸取溫度、浸取時間、浸取液pH，以核桃青皮總黃酮提取率為因變量，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面法實驗設(shè)計，如表1所示。

表1　響應(yīng)面實驗因素水平和編碼

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

3.2.1 響應(yīng)面實驗分組設(shè)計及結(jié)果

浸取溫度、浸取時間、浸取液pH的三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面法分析實驗設(shè)計及提取率結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面實驗分組設(shè)計與結(jié)果

3.2.2 建立響應(yīng)面模型擬合及方差分析

以浸取溫度、浸取時間、浸取液pH為考察因素，以總黃酮提取率為評價指標(biāo)，使用Design-Expert10.0.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到二次多項式回歸方程如下：

=7.498+0.0425-0.055-0.0425+0.0525+0.0375+0.0575-0.595252-0.520252-0.585252（2）

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。浸取溫度、浸取時間、浸取液pH三個因素對總黃酮提取率影響均顯著，其中浸取時間對總黃酮提取率影響最顯著。該模型＜0.000 1，說明此模型差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而且實驗?zāi)Ｐ团c真實數(shù)據(jù)擬合程度良好，可用于分析和預(yù)測核桃青皮總黃酮提取率最優(yōu)提取工藝。

表3　響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

續(xù)表3響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

注：2=0.996 7，Adj2=0.992 4，Pred2=0.965 4。

3.2.3 響應(yīng)曲面分析

不同因素間的交互作用對總黃酮提取率的影響見圖7至圖9。

由圖7可見，浸取溫度和浸取時間交互作用下的總黃酮提取率呈拋物面分布，當(dāng)浸取溫度不變時，總黃酮提取率隨浸取時間的延長呈先升后降趨勢；當(dāng)浸取時間一定時，總黃酮提取率隨浸取溫度的升高也呈先升后降趨勢；由曲面波動幅度可見浸取時間較浸取溫度對總黃酮提取率的影響更為顯著?？傻玫絻梢蛩氐淖顑?yōu)工藝組合在浸取溫度54 ℃～57 ℃、浸取時間28 min～32 min。

由圖8可見，浸取液pH和浸取溫度的交互作用等高線呈近圓形，表明二者的交互作用對總黃酮提取率影響不顯著?？傸S酮提取率隨浸取液pH和浸取溫度的增加呈現(xiàn)先增后減變化，當(dāng)浸取溫度為54 ℃～57 ℃，浸取液pH取5.9～6.1水平區(qū)間值時，總黃酮提取率最高。

由圖9可見，浸取時間與浸取液pH交互作用曲面圖縱向跨度較大，值小于0.05，表明二者交互作用對總黃酮提取率影響顯著。當(dāng)浸取時間在28 min～32 min水平區(qū)間，浸取液pH在5.9～6.1時，總黃酮提取率最高。

圖7　浸取溫度和浸取時間的交互作用對總黃酮提取率的影響

圖8　浸取溫度和浸取液pH的交互作用對總黃酮提取率的影響

最后，綜合回歸方程的方差分析結(jié)果和響應(yīng)曲面分析結(jié)果，采用Design-Expert 10.0.1軟件進(jìn)行分析，得到超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮的最優(yōu)工藝：浸取溫度為55.16 ℃，浸取時間為29.465 min，浸取液pH為5.981，預(yù)測總黃酮提取率為7.501％。

3.3 驗證實驗結(jié)果

根據(jù)軟件預(yù)測結(jié)果，考慮到操作的可行性，最后確定的最優(yōu)工藝參數(shù)如下：浸取溫度為55 ℃，浸取時間為30 min，浸取液pH為6。在此工藝條件下進(jìn)行三組平行實驗，得到總黃酮提取率平均值為7.53％，與預(yù)測值7.501％接近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝的方法有效可行。

4 結(jié)論

本文通過單因素實驗和響應(yīng)曲面分析法確定了超聲波輔助復(fù)合酶法提取核桃青皮總黃酮的最優(yōu)工藝，工藝參數(shù)分別為復(fù)合酶配比（果膠酶/纖維素酶）為1∶1，浸取溫度為55 ℃，液料比（g/mL）為1∶35，浸取時間為30 min，浸取pH為6。該工藝條件下三組平行實驗的總黃酮提取率平均值為7.53％。

[1]潘富赟,張培正.核桃青皮的綜合應(yīng)用及開發(fā)前景[J].中國食物與營養(yǎng),2020(12):21-24.

[2]龍思帆,王麗,李堃,等.以核桃青皮為主要原料的有機(jī)肥發(fā)酵工藝研究[J].中國沼氣,2022,40(3):38-42.

[3]杜慧平,趙瑞芬,燕照玲.核桃青皮活性物質(zhì)提取方法及其抑菌作用研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,46(9):1-5.

[4]鐘玲,尹蓉莉,張仲林.超聲提取技術(shù)在中藥提取中的研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī),2007,9(6):84-87.

[5]COUMULESCU S N,TRANDAFIR I,ACHIM G,et al.Juglonecontent in leaf and green husk of five walnut (Jugl-ansregia L.) cultivars[J].Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj–Napoca,2011,39(1):237-240.

[6]于敬,周晶.生物酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25(5):340-344.

[7]秦國杰,安曉寧,左力翔,等.不同干燥方式對核桃青皮品質(zhì)的影響[J].現(xiàn)代園藝,2020(8):4-5.

[8]LI X C,CHEN D F,MAI Y,et al.Concordance between antioxidant activities in vitro and chemical components of Radix Astragali[J].Natural Product Research,2012,26(11):1050-1053.

[9]李紅娟,樊金拴,鄭濤,等.響應(yīng)面法優(yōu)化核桃青皮黃酮的超聲提取工藝研究[J].北方園藝,2013(14):132-136.

[10]趙成萍,陳勝萍,劉曉光,等.響應(yīng)面法優(yōu)化山楂果肉總黃酮閃式提取研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2022,54(4):140-145.

[11]楊全,周毅生,李嘉俊,等.纖維素酶-乙醇協(xié)同提取龍須藤總黃酮的工藝研究[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報,2017,33(1):28-32.

[12]魏晴,鄭雙,何蘭鳳,等.響應(yīng)面法優(yōu)化米槁葉片黃酮的提取工藝[J].化學(xué)工程師,2022,36(7):84-88,62.

[13]吳淑清,艾叢蘋,欒茗然,等.復(fù)合酶協(xié)同超聲輔助提取東北土當(dāng)歸葉中總黃酮及其抑菌活性的研究[J].江蘇調(diào)味副食品,2021(3):37-40.

Study on the Extraction of Total Flavonoids from Walnut Green Husk by Ultrasonic-assisted Compound Enzyme Method

Zhang RunhongXie JianjunZhao Li

（Lanzhou Petrochemical University of Vocational Technology, Lanzhou, Gansu, 730000）

In order to find an optimal technology of extracting total flavonoids from walnut green husk efficiently with water as solvent, so as to return walnut green husk compost to farmland and forest, the extraction of total flavonoids from walnut green husk by ultrasonic-assisted compound enzyme method was studied in this experiment. Firstly, the influence of factors such as compound enzyme ratio, extraction temperature, material liquid ratio, extraction time and pH of extraction solution on the extraction rate of total flavonoids from walnut green husk was analyzed by single factor experiment. Then, the extraction process conditions were optimized by response surface analysis. Finally, the optimization results were verified by three groups of parallel experiments. The results showed that in the ultrasonic environment with power of 100 W, when the ratio of compound enzyme (pectinase/cellulase) was 1:1, the extraction temperature was 55 ℃, the ratio of liquid to material (g/mL) was 1:35, the extraction time was 30 min, and the pH of the extraction solution was 6, the extraction rate of total flavonoids was the highest, about 7.53%.

Walnut Green Husk;Ultrasonic; Compound Enzyme; Total Flavonoids; Extraction Process

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.10.15

TQ914

A

2095-1205(2022)10-49-06

蘭州石化職業(yè)技術(shù)大學(xué)2021年度教科研項目（KJ2021- 12）

張潤紅（1987- ），女，甘肅慶城人，本科，講師，研究方向為化工教學(xué)與天然藥物有效成分分離。