腫瘤來源外泌體miR?106a對肝母細胞瘤及其免疫微環(huán)境的影響

任巧利 李艷超

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（廣州 510006）

肝母細胞瘤（Hepatoblastoma，HB）是最常見的兒童肝臟惡性腫瘤，約占兒童肝臟相關(guān)腫瘤的50%［1］，雖然手術(shù)聯(lián)合化療的治療策略對HB患者的預(yù)后有所改進，但是由于其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題，患者預(yù)后仍然很差［2-3］。盡管Wnt/?catenin和Hippo信號通路被報道和HB發(fā)病有關(guān)，但是對這種疾病的分子機制認知仍然很少［4］，在臨床上仍然缺乏有效的靶向藥物。因此，尋找在HB中有改變的靶點和信號通路，對于開發(fā)新的治療藥物，改善患者預(yù)后，具有重要意義。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與周圍間質(zhì)的改變息息相關(guān)，癌細胞可以通過分泌各種細胞因子、外泌體和其他因素對周圍腫瘤細胞重新編程，改變周圍腫瘤細胞的生存和轉(zhuǎn)移能力［5］。腫瘤來源外泌體作為一種重要的細胞與細胞間物質(zhì)交換和信息傳遞的途徑，在腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用［6］。miRNA是外泌體中最主要的RNA種類［6］。研究顯示，miR?106a與腫瘤關(guān)系密切，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程［7-9］。

腫瘤微環(huán)境中浸潤有豐富的免疫細胞，其構(gòu)成的免疫微環(huán)境對于腫瘤生長的影響十分顯著［10］。越來越多的研究證明，腫瘤本身分泌的細胞因子可以重塑腫瘤免疫微環(huán)境［11］。骨髓來源的抑制性細胞（MDSCs）是一種抑制性的免疫細胞，大量研究證實腫瘤中的MDSCs可以通過抑制CD8+T細胞的浸潤或功能，發(fā)揮其促腫瘤效應(yīng)［12-14］。然而，目前尚未有研究探索HB細胞來源的miR?106a對腫瘤細胞及免疫微環(huán)境的影響。

本研究首次揭示了HB細胞及外泌體中高表達miR?106a，首次闡述miR?106a對于HB自身功能及其免疫微環(huán)境的作用，為明確腫瘤惡化的機制及發(fā)掘腫瘤治療的新靶點打開一扇新的窗口。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑人肝母細胞瘤細胞系HepG2、HuH6和人肝正常細胞L?02均購自美國ATCC菌種保藏庫。PCR引物由上海生工設(shè)計并合成。miR?106a mimics及miR?106a inhibitors由上海吉馬基因生物設(shè)計并合成。雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天）、Mir?X miRNA First?Strand Synthesis Kit（Takara）（Takara）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen）購自優(yōu)寧維。Western blot抗體CD63（Abcam）、CD9（Abcam）、Hsp70（Abcam）、PTEN（CST）、p?AKT（CST）、AKT（CST）、GAPDH（BOSTER），羊抗兔及羊抗鼠二抗購自廣州君達生物。增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒購自廣州一科生物。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HepG2、HuH6和L?02均培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，使用LipofectamineTM3000（InvitrogenTM）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR?106a mimics或miR?106a inhibitors。

1.3 外泌體的提取分離和鑒定HepG2、HuH6和L?02細胞系使用無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集細胞培養(yǎng)液。依次離心300g（10 min）、3 000g（10 min）、10 000g（30 min）、10 000～20 000g（70 min 2次），分別去除死細胞、細胞碎片等，提取外泌體。

超速離心分離得到的外泌體使用醋酸雙氧鈾（磷鎢酸）處理后，80 kV進行電鏡檢測成像。使用激光粒度分析儀，設(shè)定測試樣品的光學(xué)參數(shù)，采用二次水測定樣品背景。背景測定后，加入分散好的樣品，控制其濃度在測試范圍內(nèi)，收集數(shù)據(jù)并對數(shù)據(jù)。

在外泌體中加入50 μL細胞裂解液，提取外泌體總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western blot檢測CD63、Hsp70和CD9的表達。

1.4 熒光定量PCR（RT?qPCR）提取外泌體或細胞的總RNA，按照Mir?X miRNA First?Strand Syn?thesis Kit（Takara）試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物序列：miR?106a，GAAAAGCTG?GGTTGAGAGGA；U6?F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6?R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。檢查溶解曲線，采用2-ΔΔCt法計算miR?106a的相對表達量。

1.5 Northern blotTrizol法提取肝母細胞瘤細胞系總RNA，將變性后的RNA樣品用15%TBE?尿素凝膠分離RNA，電泳條件：100 V，120 min；再以30 V，120 min條件將RNA轉(zhuǎn)移至正電荷尼龍膜上。膜上的RNA用紫外線（UV）光交聯(lián)，用地高辛標記的探針對miR106a或U6snRNA進行37℃孵育過夜。次日用地高辛孵育尼龍膜1 h，以Digwashingbuffer洗膜4次15 min。再37℃孵育CSPD發(fā)光液20 min，于全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灨鶕?jù)miRDB、miR Tar Base、miR Walk和Target Scan在線miRNA靶基預(yù)測工具預(yù)測的PTEN結(jié)合核苷酸序列，設(shè)計含有PTEN結(jié)合位點的基因片段（WT?PTEN）和突變的PTEN核苷酸序列（MUT?PTEN），將其克隆至熒光載體psi CHECK2，構(gòu)建熒光素酶報告基因。將其與miR?NC，miR?106a共轉(zhuǎn)染至HepG2細胞。最后按照雙熒光素酶報告實驗試劑盒要求，檢測熒光活性并計算結(jié)果。

1.7 CCK8實驗取對數(shù)生長期細胞種板后，按照CCK8試劑盒說明書檢測細胞的增殖能力。

1.8 Western blot實驗提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，進行SDS?PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉，孵育一抗過夜。次日孵育二抗曝光。

1.9 Transwell遷移實驗使用Transwell小室，上層種細胞，下層分別加入不同條件培養(yǎng)基，遷移8 h后收取細胞樣品。

1.10 劃痕實驗把細胞均勻接種至六孔板中，用10 μL槍頭縱向劃3條大小均一的直線劃痕，PBS清洗后用10×物鏡拍照；加入相對應(yīng)的藥物，每隔24 h更換無血清培養(yǎng)基后拍照，用軟件計算劃痕愈合情況。

1.11 人肝母細胞瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立將10只5周齡BALB/c?nu/nu雌性裸鼠，隨機分為PBS與miR?106a兩組。皮下接種HepG2細胞，在腫瘤結(jié)節(jié)形成一周時，對照組瘤內(nèi)注射PBS（2 d/次），實驗組注射外泌體miR?106a（10 μg/只，2 d/次），連續(xù)注射3次，隔天測量皮下腫瘤體積。21 d后，取小鼠腫瘤，測量并拍照。

1.12 Elisa用10%FBS DMEM培養(yǎng)目的細胞72 h，收集上清，離心去除細胞碎片。根據(jù)Elisa試劑盒（R&D Systems）說明書指示，定量檢測VEGF的表達量。

1.13 腫瘤組織單細胞懸液制備從小鼠的皮下腫瘤組織中制備單細胞懸液。分離皮下腫瘤后30 min內(nèi)采集組織標本并剪碎，用50 μL DNaseI（10 mg/mL，1∶100）和50 μL膠原酶Ⅱ（200 mg/mL，1∶100）在37℃下孵育20 min，組織研磨后用PBS重懸并用70 μm細胞濾網(wǎng)過濾，獲得組織濾液。將組織濾液500g離心10 min，PBS重懸獲得單細胞懸液。

1.14 流式細胞術(shù)單細胞懸液用50 μL Stain buffer（BD）重懸，加入CD45（BD）、Gr?1（BD）、CD11b（BD）抗體染色20 min，用1 mL Stain buffer中止染色，500g離心5 min后用1%多聚甲醛固定，在流式細胞分析儀（BD FACS LSR Fortessa TM）分析數(shù)據(jù)。

1.15 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)處理使用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Graph Pad Prism 9.0進行繪圖。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用雙尾獨立樣本t檢驗。本文實驗結(jié)果所有數(shù)值均以三次獨立實驗數(shù)據(jù)的均數(shù)±標準差表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?106a在肝母細胞瘤中高表達qRT?PCR結(jié)果顯示，與正常肝細胞系（L?02）相比，HB細胞系（HepG2、Huh6）中miR106a表達明顯升高（P<0.001，圖1A）。Northern blot結(jié)果與qRT?PCR一致（圖1B）。

圖1 miR?106a在肝母細胞系中的表達Fig.1 Expression of miR?106a in HB cell lines

2.2 HB細胞系來源外泌體中miR?106a的表達情況電鏡下觀察HepG2培養(yǎng)上清中提取外泌體的形態(tài)為橢圓形，茶托狀，具有完整的雙層脂質(zhì)膜包被（圖2A）。粒徑分析表明外泌體的直徑在30～150 nm之間（圖2B）。Western blot檢測表明，外泌體標志蛋白CD63、Hsp70和CD9陽性表達（圖2C）。隨后，qRT?PCR檢測了HepG2、HuH6與L?02外泌體的miR?106a表達，結(jié)果顯示，HepG2、HuH6細胞外泌體的miR?106a表達顯著上調(diào)（P<0.001，圖2D）。

圖2 外泌體的分離和鑒定Fig.2 Isolation and identification of exosomes

2.3 外泌體miR?106a促進肝母細胞瘤細胞的增殖和遷移在HepG2細胞中分別轉(zhuǎn)染HepG2?Exos、miR?106a mimics、miR?106a inhibitors和HepG2?Exos+miR?106a inhibitors。CCK8與Transwell實驗表明，與對照組相比，HepG2?Exos、miR?106a mim?ics組細胞增殖與遷移能力顯著增強，而miR?106a inhibitors組細胞增殖與遷移能力明顯減弱。此外，共轉(zhuǎn)染HepG2?Exos和miR?106a inhibitors能夠逆轉(zhuǎn)miR?106a inhibitors對HepG2細胞增殖和遷移的抑制效果（P<0.01，圖3A?B）。

同時，細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果趨勢一致，共同表明了HB細胞系來源外泌體miR?106a能夠提高HB細胞的遷移能力（圖3C）。

圖3 外泌體miR?106a對肝母細胞瘤細胞增殖和遷移的影響Fig.3 Effects of exosome miR?106a on proliferation and migration of hepatoblastoma cells

2.4 外泌體miR?106a靶向PTEN激活A(yù)KT信號通路，上調(diào)VEGF的分泌生信分析預(yù)測miR?106a能靶向PTEN mRNA的3'UTR區(qū)（圖4A）。雙熒光素酶報告基因驗證實驗結(jié)果顯示，miR?106a可顯著抑制野生型PTEN（WT?PTEN）組的熒光素酶活性（P<0.001），而對突變型PTEN（MT?PTEN）組無影響（圖4B?C）。Western blot結(jié)果顯示，與NC?Exos對照組相比，轉(zhuǎn)染miR?106a組PTEN蛋白表達明顯下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR?106a inhibitors組PTEN蛋白表達明顯上調(diào)（圖4D）。

Western blot檢測PTEN、磷酸化AKT（p?AKT）和AKT的表達。結(jié)果表明，與NC?Exos對照組相比，miR?106a mimics或miR?106a?exos處理的HepG2細胞中，PTEN水平顯著降低，p?AKT水平升高（圖4D）。Elisa結(jié)果表明，與Control組相比，miR?106a mimics或miR?106a?exos處理的HepG2細胞VEGF的分泌水平顯著升高（P<0.001），抑制miR?106a后，VEGF的分泌顯著下降（P<0.01，圖4E）。以上結(jié)果提示，HB細胞系來源的外泌體miR?106a通過調(diào)控PTEN?AKT信號通路促進HepG2細胞分泌VEGF。

圖4 miR?106a靶基因的預(yù)測和鑒定Fig.4 Prediction and identification of miR?106a target gene

2.5 外泌體miR?106促進MDSC的募集，促進腫瘤生長為了在體內(nèi)證實miR?106a對于肝母細胞瘤生長的作用。本研究通過裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，miR?106a組腫瘤負荷顯著高于對照組（P<0.001，圖5A?B）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，miR?106a組PTEN水平顯著降低，p?AKT水平顯著升高（圖5C）。同時，RT?qPCR結(jié)果顯示miR?106a組顯著上調(diào)了VEGF的表達（P<0.001，圖5D）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，外泌體miR?106a組MDSC顯著增多（P<0.001，圖5E?F）。綜上，miR?106a可以促進p?AKT的活化，并上調(diào)VEGF的表達，募集MDSC進入腫瘤，促進腫瘤生長。

圖5 miR?106a重塑免疫微環(huán)境并促進腫瘤生長Fig.5 miR?106a reshapes the immune microenvironment and promotes tumor growth

3 討論

肝母細胞瘤是一種起源于肝母細胞的兒童惡性腫瘤，過去的幾十年中，肝母細胞瘤的發(fā)生率以每年2.7%的速率增長［15］。盡管外科手術(shù)和化療方案的聯(lián)合提高了一部分患者的生存率，但是仍有25%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移［16］。因此，急需探索新的有效的HB治療靶點。

微小RNA（miRNA）是小的非編碼RNA，其通過抑制靶mRNA翻譯起作用［17］。最近有研究表明，高水平的miRNA和外泌體miRNA已經(jīng)表現(xiàn)出對多種腫瘤類型的免疫調(diào)節(jié)、化療耐藥和轉(zhuǎn)移［18-19］。然而，在HB腫瘤中，腫瘤來源的外泌體miRNA與轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性還不清楚。miR?106a已被證實參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響腫瘤細胞的增殖和遷移［20-22］。該研究通過qRT?PCR和Northern blot證明miR?106a在HB細胞及其外泌體中高表達，并發(fā)現(xiàn)HB細胞來源外泌體miR?106a促進了HB細胞的增殖和遷移。此外，本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了miR?106a和PTEN3'?UTR的靶向組合，并進一步通過雙熒光素酶報告基因檢測證實PTEN是miR?106a的直接靶點。PTEN是一個具有雙重特性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因［23］，在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)PTEN的突變與缺失［24-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，HB中PTEN的缺失導(dǎo)致了AKT信號通路的過度活化，AKT信號通路的活化會通過影響細胞周期促進細胞的增殖［27］。本研究中，PTEN的缺失上調(diào)了VEGF的表達，VEGF的上調(diào)被證實會促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［28］。以上結(jié)果提示，在HB中，外泌體miR?106a通過下調(diào)PTEN，活化AKT信號通路，促進VEGF的分泌，增強腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力。鑒于此，腫瘤來源外泌體中的miR?106a可能會成為肝母細胞瘤的新的治療靶點。

作為功能強大的抑癌基因，PTEN也參與了腫瘤微環(huán)境的形成。研究表明［29］，多種免疫信號傳遞通路，例如IL?2、IL?6、IL?10等也受到PTEN的調(diào)控。HAND等報道［30］，PTEN的缺失會抑制CD8+T細胞的發(fā)育和存活，同時抑制白介素?7（IL?7）和白介素?15（IL?15）受體表達。PENG等［31］發(fā)現(xiàn)，PTEN缺失會顯著降低腫瘤中CD8+T細胞的數(shù)量和活性，也促進了腫瘤對T細胞誘導(dǎo)的凋亡的抵抗。然而，目前尚未有研究報道m(xù)iR?106a通過PTEN影響HB免疫微環(huán)境的機制。本研究證實，miR?106a通過抑制PTEN，活化p?AKT，活化的AKT信號通路可以通過HIF?1α促進VEGF及其他血管生成因子的表達和分泌［32］，本研究證實p?AKT的活化促進了VEGF的分泌（圖4E、圖5D）。VEGF在血管生成中的作用已經(jīng)被充分證實［33］。此外，VEGF還可以通過募集抑制性免疫細胞，如未成熟樹突細胞、MDSCs和調(diào)節(jié)性T細胞［34］來形成抑制性免疫微環(huán)境。該研究證實，miR?106a抑制了PTEN表達，活化p?AKT，上調(diào)VEGF的表達，從而增加MDSCs的募集。MDSCs作為一種未成熟的髓源性免疫抑制細胞，可以通過上調(diào)iNOS和Arg?1的活性消耗體內(nèi)環(huán)境中的L?精氨酸，使T細胞的生成受阻［35］，或通過產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）來抑制T細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［36］，促進舌鱗狀細胞癌進展［37］。

研究顯示，miR?106a通過上調(diào)VEGF募集MDSCs進入腫瘤，腫瘤中富集的MDSCs可能會通過產(chǎn)生ROS或消耗L?精氨酸抑制T細胞對腫瘤的殺傷的功能，進而增加腫瘤負荷。

綜上，本研究首次證實了HB細胞及其外泌體中高表達miR?106a，外泌體中的miR?106a通過影響周圍腫瘤細胞PTEN/AKT/VEGF信號通路促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移；此外，miR?106a通過PTEN?AKT信號通路上調(diào)VEGF的表達，募集MDSCs進入腫瘤，形成抑制性免疫微環(huán)境，促進腫瘤生長。因此，HB來源的miR?106a可以作為一種新的致癌因子，為肝母細胞瘤的診斷和治療提供了新的見解。然而，在本文中尚未證實miR?106a在HB細胞及其外泌體中高表達的機制，有待下一步的探索。