常見血紅蛋白變異體對離子交換高效液相色譜法檢測糖化血紅蛋白的影響＊

潘少霞，陳冬蓮，劉艷晨，章青英，陳曉英，劉首明

（廣東省清遠市中醫(yī)院檢驗中心，清遠511500）

糖化血紅蛋白（HemoglobinA1c，HbA1c）是臨床評價糖尿病患者長期血糖控制的常用生化指標[1-4]。已知，血紅蛋白病和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病對多種HbA1c檢測方法（免疫抑制比濁和親和層析法等）構成不同程度的干擾[5,6]。廣東省清遠市是血紅蛋白病和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病的高發(fā)地區(qū)，以Hb E、Hb G-Taipei、Hb Newyork及Hb J-Bangkok等β鏈上的異常血紅蛋白類型為主[7-9]。目前，本地區(qū)常見血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c的干擾尚未明確，容易被臨床醫(yī)生和患者忽視。為此，廣東清遠中醫(yī)院開展本項檢測，旨在探討常見血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c的干擾程度和干擾因素，為IE-HPLC檢測HbA1c提供明確的警告提示信息，確保HbA1c的實驗室檢查能準確可靠地服務于臨床。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月-2019年6月廣東清遠市中醫(yī)院二型糖尿病患者行IEHPLC測定HbA1c的水平、已糖激酶法測定血漿葡萄糖的水平、毛細管電泳法分析血紅蛋白性質和雙脫氧鏈終止法進行血紅蛋白基因測序的40例體檢者的診斷學資料。其中，性別：男20例，女20例；年齡26～67周歲，平均（52.86±5.34）周歲；疾病類型：2型糖尿病患者30例，妊娠期糖尿病10例。納入標準：具有完整病歷資料；IE-HPLC檢測HbA1c圖譜出現(xiàn)變異峰。排除標準：血液系統(tǒng)疾病患者；近期服用過保泰松及阿司匹林等具有骨髓抑制作用的藥物的人群。

1.2 方法 抽取受試者清晨空腹狀態(tài)下的肘靜脈血4 ml，置于生化分離管當中，以3000r/min轉速對血液標本進行5min的離心，靜置后分離血清，放置在-80℃血清儲存箱中保存，待檢。采用對離子交換高效液相色譜法（IE-HPLC）測定HbA1c的水平，儀器為全自動HbA1c分析儀（生產單位：美國伯樂公司，型號：BIO-RAD VAKIANTⅡ），糖化血紅蛋白AIC試劑盒購自美國伯樂生物科技有限公司；采用葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖的水平，儀器為全自動生化分析儀（生產單位：貝克曼庫爾特商貿有限公司，型號：BECKMAN COULTER AU5800），試劑盒購自美康生物科技股份有限公司；采用毛細管電泳法分析血紅蛋白性質，儀器為全自動毛細管蛋白電泳分析儀（生產單位：海倫娜生物科技公司，型號：V8），試劑盒購海倫娜生物科技公司；采用雙脫氧鏈終止法進行血紅蛋白基因測序，交廣州金域檢驗實驗室進行實驗。所有試驗操作嚴格按照試驗說明書及實驗室標準操作進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均經SPSS 20.00統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，采用描述性統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)進行直線偏差百分比分析。

2 結果

2.1 表型結果 40例體檢者HbA1c測定結果與血糖檢測結果均出現(xiàn)明顯偏差，均超出IE-HPLC的定量分析范圍，詳見表1。檢測圖譜顯示：40例體檢者的檢測圖譜均出現(xiàn)變異峰；序號1、3及6體檢者，HbA和HbA1c出峰時間提前；序號4及7體檢者，HbA1c出峰時間滯后，變異峰分別占總面積53.74%、55.16%；序號8體檢者，HbA1c出現(xiàn)變異峰，占總面積92.34%，具體見表1。

表1 體檢者表型檢測結果

2.2 毛細管蛋白電泳結果 毛細管蛋白電泳結果顯示，40例體檢者均出現(xiàn)的異常血紅蛋白區(qū)帶。檢測圖譜顯示：序號1、3及6體檢者，HbA變異峰分別占總面積1.56%、1.08%和2.49%，HbA2變異峰分別占總面積5.01%、5.91%和7.91%，HbA1c變異峰分別占總面積1.04%、1.22%和2.07%；序號2及5體檢者，HbA變異峰分別占總面積40.76%和40.70%，HbA2變異峰分別占總面積2.66%和2.77%，HbA1c變異峰分別占總面積1.95%和2.35%；序號4及7體檢者，HbA變異峰分別占總面積70.18%和70.27%，HbA2變異峰分別占總面積3.59%和3.69%，HbA1c變異峰分別占總面積21.82%和27.25%；序號8體檢者，HbA變異峰占總面積50.38%，HbA2變異峰占總面積3.01%，HbA1c變異峰占總面積62.99%，具體見表2。

表2 毛細管蛋白電泳結果

2.3 基因測序結果 基因測序結果顯示，40例體檢者的血紅蛋白β鏈均發(fā)生突變基因，詳見表3。

3 討論

HbA1c是血清中的糖類與紅細胞中的血紅蛋白相結合化合物，其反應過程緩慢、持續(xù)且不可逆，能夠反映了紅細胞生命周期內的平均血糖水平[10]。由于，血紅蛋白變異體廣泛出現(xiàn)在血紅蛋白病和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病，而正常血紅蛋白與異常血紅蛋白的理化性質存在差異[11]。IEHPLC檢測HbA1c的工作原理決定了其有可能被血紅蛋白變異體干擾，導致HbA1c測定結果存在過大偏倚。若HbA1c測定結果存在過大偏倚會誤導臨床對疾病的評估和治療，不利于改善患者預后，甚至增加醫(yī)療不良事件的風險[12]。因此，了解本地區(qū)常見血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c是否存在干擾及其干擾程度和干擾因素，有助于提高HbA1c的實驗室檢查的準確性。

表型結果顯示，本組40例體檢者HbA1c測定結果與血糖檢測結果均出現(xiàn)明顯偏差，均超出IEHPLC的定量分析范圍。毛細管蛋白電泳結果顯示,本組40例體檢者均出現(xiàn)的異常血紅蛋白區(qū)帶，其變異峰有不同的表達。提示，本組40例體檢者均存在血紅蛋白變異體,血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c構成不同程度干擾?；驕y序結果進一步顯示，本組40例體檢者的血紅蛋白β鏈均發(fā)生突變基因，突變點位有GGC→GAC、GAG→AAG和GAA→GGA，血紅蛋白基因型有β41-42/βJBangkok、βN/βJ-Bangkok、βN/βE和βN/βG-Taipe。與溫冬梅等[13]研究者報道結果一致，提示Hb E、Hb G-Taipei、Hb Newyork及Hb J-Bangkok等血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c構成不同程度干擾。

表3 基因測序結果

IE-HPLC測定HbA1c受到血紅蛋白變異體干擾的可能機制為：⑴序號1、3及6體檢者的血紅蛋白基因型均為β41-42/βJ-Bangkok，HbA1c測定結果偏低可能是因為珠蛋白鏈Gly替換為Asp，變異體的糖化速率低于HbA的糖化速率，HbA1c又作為變異體糖化產物,導致變異體糖化產物不能準確反映血糖水平；HbA和HbA1c出峰時間提前可能是因為珠蛋白鏈Gly替換為Asp，增加了負電荷的數(shù)量[14]。⑵序號2及5體檢者的血紅蛋白基因型均為βN/βJ-Bangkok，由于β41-42/βJ-Bangkok與βN/βJ-Bangkok理化性質類似，因此其HbA1c測定結果偏低的可能機制與β41-42/βJ-Bangkok一致[15]。⑶序號4及7體檢者的血紅蛋白基因型均為βN/βE，HbA1c測定結果假性增高可能是因為Glu替換為Lvs，HbA1c出峰時間滯后,導致HbA被誤讀為Variant Window峰，Hb E被誤讀為HbA[16]。⑷序號8體檢者的血紅蛋白基因型為βN/βGTaipe，HbA1c測定結果假性增高可能是因為Glu替換為Gly，雜合子的峰形不能完全分離，未能正確讀取HbA[17,18]。

綜上所述,本研究探討了常見血紅蛋白變異體對IE-HPLC檢測HbA1c的干擾程度和干擾因素；本地區(qū)作為血紅蛋白病和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病的高發(fā)地區(qū)，選擇IE-HPLC檢測HbA1c時應更為謹慎；對于血紅蛋白病和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病可選擇果糖胺和（或）糖化血清蛋白等指標代替HbA1c評估患者的血糖水平。