神經(jīng)營養(yǎng)素對牙髓干細胞神經(jīng)向分化的影響

薛 冰，席花蕾，姚麗紅，徐婉秋，許曉航，王秀梅

牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是一類獨特的間充質干細胞,來源于胚胎時期神經(jīng)嵴的外胚間充質組織,與骨髓間充質干細胞有著相似的生物學特性,如多向分化、高度增殖及自我更新能力等,這些特性決定了DPSCs可以替代骨髓間充質干細胞，為神經(jīng)性疾病研究提供更便捷的細胞來源[1-2]。Gronthos等在2000年采用酶消化法首次成功地分離出DPSCs并對其特性進行了深入的實驗研究,發(fā)現(xiàn)DPSCs能夠在mRNA及蛋白水平上表達神經(jīng)前體細胞和膠質細胞的標志性產(chǎn)物——巢蛋白和膠質纖維酸性蛋白,同時能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophin, NT)[3], Goorha等從脫落的牙齒中提取出原代DPSCs進行培養(yǎng)傳代并在神經(jīng)分化培養(yǎng)基下誘導,24 h后便觀測到細胞呈神經(jīng)元形態(tài)發(fā)展[4],這說明DPSCs具有神經(jīng)向分化的潛能。Kang的實驗采用3種不同的培養(yǎng)方案均成功誘導DPSCs分化出膽堿能神經(jīng)元,當DPSCs暴露在不同的神經(jīng)誘導條件下時,細胞開始神經(jīng)向分化,其mRNA和蛋白表達與成熟神經(jīng)元一致,證實了DPSCs具有神經(jīng)向分化的潛能[5]。NT是一類由神經(jīng)所支配的細胞或組織產(chǎn)生的蛋白質分子,可以分為神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs)家族、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factors, GDNF)家族、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)細胞因子家族、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族等,NT既可以由DPSCs分泌表達,也能夠影響DPSCs神經(jīng)向分化中軸突的發(fā)生,支持神經(jīng)細胞的存活[6-7]。近年來,NT在誘導DPSCs神經(jīng)向分化過程中所扮演的角色得到了越來越多的關注,本文旨在對NT促進DPSCs神經(jīng)向分化進行簡單的總結歸納。

1 關于神經(jīng)營養(yǎng)素家族的概述

1.1 NTFs家族

NTFs是一種分泌型蛋白質,能夠促進軸突生長、神經(jīng)細胞分化和存活,通過影響不同的靶細胞群,在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用,NTFs包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3, NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(neurotrophin-4/5, NT-4/5)等。由于NTFs在感覺和交感神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中可以促進軸突的生長、幫助損傷的神經(jīng)細胞恢復功能,所以常常應用于神經(jīng)損傷的治療中,其對早期神經(jīng)元抗凋亡、保護軸突和髓鞘免受刺激性損傷有積極的作用,通過支持神經(jīng)細胞的存活和發(fā)生發(fā)展來促進神經(jīng)分化和調節(jié)神經(jīng)生長[8-9]。

NTFs通過與相應的受體結合發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。NTFs受體主要包括原肌球蛋白受體激酶A(tropomyosin receptor kinase A, TrkA)和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75(p75 neurotrophic factor receptor, p75NTR),其中TrkA是 Trk原癌基因產(chǎn)物,屬于受體酪氨酸激酶家族,p75NTR屬于TNF/Fas/CD40/CD30受體家族。研究表明,Trk基因家族由TrkA、TrkB、TrkC3個特征基因組成,TrkA為NGF高親和力結合位點;TrkB對BDNF和NT-4的親和力較高;而TrkC受體則主要與NT-3結合。p75NTR可以作為所有NTFs的低親和力受體,但它與每種因子的結合特征略有不同,其激活可誘導細胞的存活或凋亡,具體取決于與p75NTR受體所結合因子的特性[10]。不同類型的NTFs通過與DPSCs表面相關受體結合,對DPSCs神經(jīng)向分化產(chǎn)生不同的影響[11-12]。

1.2 GDNF家族

GDNF是一種能有效促進運動神經(jīng)元存活和調節(jié)軸突生長的因子,其來源于神經(jīng)膠質細胞,屬于GDNF配體家族(GDNF family of ligands, GFLs),其成員還包括neuturin (NRTN)、artemin (ARTN)和persephin (PSPN)[13]。GFLs對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復及誘導干細胞神經(jīng)向分化均能起到一定的促進作用[14]。

有研究表明GFLs 依賴于與復合受體結合來傳遞信號,復合受體包括功能性受體——跨膜受體酪氨酸激酶蛋白RET和特異性受體——GDNF家族受體α(glial cell line-derived family receptor α, GFRα),GDNF優(yōu)先與GFRα1結合；NRTN則結合GFRα2；ARTN與GFRα3；PSPN結合GFRα4,GFLs與其對應的優(yōu)先受體特異性結合后激活RET磷酸化,從而激活下游信號通路來發(fā)揮促細胞神經(jīng)向分化的作用,如GDNF與GFRα1結合后激活了胞質酪氨酸激酶Fyn和FAK,這是施萬細胞遷移和神經(jīng)元軸突生長必不可少的部分[15]。GDNF與GFRα1結合激活RET磷酸化可促進神經(jīng)元存活，同時還能保護培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元,起到運動神經(jīng)營養(yǎng)功能,同時GFLs介導的信號級聯(lián)在髓鞘形成、增殖和遷移中也起到重要作用[16]。

1.3 白細胞介素-6細胞因子家族

白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的，通常被認為是促炎細胞因子,然而,由于IL-6能夠誘導神經(jīng)元存活、增殖、分化和再生,影響神經(jīng)遞質突觸的釋放及神經(jīng)活性,IL-6也可以被歸類為NT[17]。IL-6屬于一組四螺旋束細胞因子,其家族成員還包括睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、抑癌素M(oncostatin M, OSM)、白細胞介素-11(interleukin-11, IL-11)等[18]。

IL-6信號傳遞是通過構建IL-6與跨膜型IL-6受體(mIL-6R)或可溶性IL-6受體(sIL-6R)及信號轉導亞單位分子gp130復合物來傳導的。IL-6在炎癥性疾病及神經(jīng)組織生理穩(wěn)態(tài)中主要通過兩條途徑發(fā)揮效應,一種是經(jīng)典信號傳遞——IL-6與mIL-6R結合激活gp130,進而激活下游信號轉導；另一種是IL-6與sIL-6R結合構成反式信號傳遞,或通過IL-6R與附近定位細胞上的gp130結合反式遞呈,激活JAK/STAT通路促進少突膠質細胞的分化。IL-6在發(fā)揮誘導細胞神經(jīng)向分化的功能主要歸功于sIL-6R[19-20]。

1.4 FGF家族

FGF是目前研究較多的生長因子之一, 已有實驗證實其能夠促進損傷神經(jīng)的再生和髓鞘的形成,具有營養(yǎng)神經(jīng)細胞、修復受損神經(jīng)細胞的作用[21]。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族中最具有代表性的成員,其能通過影響神經(jīng)細胞、施萬細胞和成纖維細胞來促進軸突的生長,在維持神經(jīng)元存活、抗凋亡和促進干細胞體外分化為神經(jīng)元樣細胞方面具有優(yōu)越性[22]。

在bFGF誘導DPSCs神經(jīng)向分化的過程中,主要是通過其特異性受體(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)激活PI3K/ATK信號通路,從而調控細胞的增殖和分化過程[23-24]。

2 不同種類NT對DPSCs神經(jīng)向分化的作用

2.1 NTFs對DPSCs神經(jīng)向分化的影響

Zhang等在實驗中將DPSCs在單獨或聯(lián)合含有NGF和bFGF的培養(yǎng)基中處理后進行分析檢測神經(jīng)干細胞標志物——巢蛋白、微管相關蛋白-2、βⅢ-微管蛋白和膠質纖維酸性蛋白的表達,結果表明,NGF或bFGF單獨存在的培養(yǎng)實驗中DPSCs均表達神經(jīng)干細胞標志物,但與單獨使用bFGF或NGF相比,bFGF和NGF協(xié)同促進DPSCs的神經(jīng)向分化更具優(yōu)越性[25],這說明NGF與bFGF均有利于DPSCs神經(jīng)向分化。Tsutsui等認為DPSCs在NGF的誘導下具有修復脊髓損傷的潛力是由于NGF的表達影響了DPSCs分化為神經(jīng)元細胞的能力[26]。Zhang等采用靜脈注射的方法將BDNF與DPSCs共同注入缺血性腦卒中的大鼠腦內(nèi),成功促進DPSCs神經(jīng)向分化,發(fā)揮了神經(jīng)保護作用,并且提高了細胞的存活率[27]?？傊?這些實驗結果均可證明NTFs可以參與DPSCs神經(jīng)向分化,調節(jié)神經(jīng)元的可塑性以及神經(jīng)細胞的生長和存活。

2.2 GDNF對DPSCs神經(jīng)向分化的影響

Xiao等利用體外實驗證實了GDNF介導DPSCs的增殖、分化主要是通過PI3K/AKT和MEK/ERK途徑實現(xiàn)的,GDNF對DPSCs向神經(jīng)及周圍血管生成和分化都能起到一定的引導作用[28]。Sarhane等實驗研究明確了GDNF能夠誘導軸突延伸,促進神經(jīng)纖維的成熟,靶向定位軸突生長,最大限度地改善誘導神經(jīng)向生長的作用[29],在GDNF的誘導下DPSCs能夠向神經(jīng)向分化,并激活DPSCs分泌NGF、BDNF以及GDNF等促進神經(jīng)營養(yǎng)因子。Ma等在研究中發(fā)現(xiàn)GDNF可以促進干細胞生長并使其分化為神經(jīng)元樣細胞,形成神經(jīng)球樣結構且表達神經(jīng)細胞標志物,GDNF及NRTN在促進多巴胺能神經(jīng)元的存活和形態(tài)分化, 增加發(fā)育中的多巴胺能神經(jīng)元在體外的存活率,對防止運動神經(jīng)元的凋亡能起到積極的作用[30-31]。這些實驗均證明GDNF能夠有助于DPSCs神經(jīng)向分化。

2.3 IL-6細胞因子家族對DPSCs神經(jīng)向分化的影響

Park等利用免疫熒光成像和Western blot對比了健康的DPSCs和炎性DPSCs在隨著IL-6濃度增加神經(jīng)向分化潛能的變化：隨著IL-6的加入,健康DPSCs的神經(jīng)分化潛能降低；炎性DPSCs的神經(jīng)發(fā)生潛能隨著中和IL-6的增加而增加,實驗證明IL-6影響DPSCs神經(jīng)向分化的潛能[32]。Ashwini等實驗利用CsA介導的CN信號使IL-6表達增加,檢測到干細胞表達神經(jīng)前體標志物增加,進一步說明IL-6能夠促進DPSCs神經(jīng)向誘導[33]。Zeng等通過RT-PCR、免疫印跡和免疫熒光顯微鏡等方法檢測標記基因和蛋白的表達，觀察到經(jīng)CNTF誘導的DPSCs能夠表達膽堿能神經(jīng)元標志物——乙酰膽堿轉移酶,證明了CNTF可以促進DPSCs向神經(jīng)元樣細胞分化[34]。總之,IL-6細胞因子家族對DPSCs神經(jīng)向分化有著積極的作用。

2.4 bFGF對DPSCs神經(jīng)向分化的影響

Zheng等將三維殼聚糖支架與bFGF聯(lián)合應用于DPSCs,通過激活ERK信號通路成功促進了DPSCs神經(jīng)向分化[35]。Alexander等利用含有bFGF和FGF等細胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)DPSCs至第7代,檢測到膠質纖維酸性蛋白、微管蛋白和少突膠質細胞標志物均呈陽性反應,這一結果清楚地表明,DPSCs經(jīng)適當?shù)纳L因子處理后,具有分化為神經(jīng)細胞的潛力[36]。在一些誘導干細胞神經(jīng)向分化的研究實驗中,誘導培養(yǎng)基中常會加入補充生長因子,在DPSCs的神經(jīng)分化過程中bFGF可以作為一個強有力的補充生長因子,Hu等表示經(jīng)bFGF預處理的DPSCs可促進神經(jīng)特異性活化,在bFGF存在的情況下,DPSCs神經(jīng)球大小增加,神經(jīng)源性標志物表達上調[37],總之,bFGF能夠促進DPSCs神經(jīng)向分化,誘導神經(jīng)突起生長。

3 總結與展望

經(jīng)誘導后神經(jīng)向分化的DPSCs具有保護神經(jīng)、營養(yǎng)神經(jīng)、血管生成以及免疫調節(jié)的特性,在神經(jīng)再生修復方面有著巨大的優(yōu)勢,可以應用在許多神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的治療中[38],如DPSCs可以作為治療阿爾茨海默病的自體源干細胞，DPSCs產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元對治療帕金森病有積極作用，DPSCs誘導神經(jīng)向分化在脊髓損傷和坐骨神經(jīng)損傷等周圍神經(jīng)損傷功能恢復方面有著顯著的效果，DPSCs對腦卒中、視網(wǎng)膜修復、新生兒缺血缺氧性腦病等疾病也能發(fā)揮積極的作用,有望早日應用于臨床治療[39-40]。DPSCs神經(jīng)向分化應用于神經(jīng)損傷性疾病的臨床治療有著光明的前景,但仍有許多障礙需要克服,如DPSCs具體調控神經(jīng)修復的機制尚不明確;特異性標志物不清楚;體外分化周期及速率難以把握;大部分的實驗研究多為細胞或動物模型,應用于人體的改變尚未可知,風險目前無法預測。因此,對DPSCs神經(jīng)向分化還需進一步研究和討論。

利益沖突聲明：無。