雙歧桿菌在家畜疾病防治中的研究與應(yīng)用

陳 穎，汪 雪，崔省委，趙清梅，余永濤★

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是由Tissier首次從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離，隸屬于放線菌門放線菌綱雙歧桿菌目雙歧桿菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，其豐度受年齡、健康狀況和飼喂方式等因素影響。在家畜幼齡時(shí)期，雙歧桿菌豐度較高，隨著年齡增加，豐度逐漸降低。雙歧桿菌可與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)腸道內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或通過與其他微生物菌群互作來抑制病原菌的增殖和粘附，或通過誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答來維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而改善腸道健康。雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道疾病防治和食品科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，近年研究表明，雙歧桿菌在改善人和動(dòng)物健康過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前雙歧桿菌制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、美容保健、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域，在動(dòng)物疾病防治中也得到了廣泛應(yīng)用。雙歧桿菌可改善家畜腸道健康、提高飼料轉(zhuǎn)化率、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等。本文就雙歧桿菌的種屬分類、在家畜疾病防治防治中的作用機(jī)理及研究和應(yīng)用進(jìn)行綜述，為雙歧桿菌的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 雙歧桿菌的種屬分類

1.1 雙歧桿菌的生物學(xué)特性雙歧桿菌為革蘭陽性菌，無運(yùn)動(dòng)性、不產(chǎn)孢、不耐酸、厭氧。雙歧桿菌的生理特性包括過氧化氫酶陰性，對(duì)氧敏感，GC含量高，對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，最適生長(zhǎng)溫度為37～41℃，最適生長(zhǎng)pH為6.5～7.0。其菌落形態(tài)多光滑，有凹凸且完整的邊緣，顏色為乳白色到白色；其細(xì)胞呈桿狀，末端分叉呈V形或Y形。在不利的生長(zhǎng)條件下，其細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出高度的多形性。研究表明，培養(yǎng)基中的N-乙酰葡萄糖、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和Ca2+濃度等對(duì)雙歧桿菌的細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響。

雙歧桿菌的碳水化合物分解代謝途徑不同于乳酸菌的同型發(fā)酵或異型發(fā)酵，而是通過特殊的雙歧支路代謝途徑，即果糖-6-磷酸途徑發(fā)酵，終產(chǎn)物為乙酸和乳酸，兩者摩爾比為3:2，還產(chǎn)生少量的甲酸和乙醇，不產(chǎn)生CO2、丙酸和丁酸。上述代謝途徑是由于雙歧桿菌缺乏醛縮酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶而含有果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（F6PPK），該酶在雙歧桿菌支路代謝中發(fā)揮著重要作用，因此F6PPK基因也可以作為雙歧桿菌分類鑒別的工具。

1.2 雙歧桿菌分類根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（2012）中，雙歧桿菌隸屬于細(xì)菌域放線菌門放線菌綱雙歧桿菌目雙歧桿菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌屬有32個(gè)種、9個(gè)亞種，來源于人類腸道、口腔、食物、動(dòng)物胃腸道、昆蟲腸道和污水等。最近，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道從靈長(zhǎng)類動(dòng)物的糞便樣本發(fā)現(xiàn)了新型雙歧桿菌。動(dòng)物源性菌株主要從豬、牛、羔羊、雞、兔子等家畜禽的糞便中分離（見表1）。

表1 動(dòng)物源性雙歧桿菌分類和來源

雙歧桿菌傳統(tǒng)分類和鑒定主要是依據(jù)表型方法，包括細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、有無芽孢、運(yùn)動(dòng)性、革蘭氏染色、營(yíng)養(yǎng)需求、糖發(fā)酵、代謝產(chǎn)物等。該類方法不能將雙歧桿菌與其他產(chǎn)乳酸細(xì)菌或乳酸桿菌完全區(qū)分開來。此外，有的雙歧桿菌無法培養(yǎng)，其表型分析缺乏可靠和明確的結(jié)果。更重要的是，有些雙歧桿菌菌株基因序列高度一致，但表型發(fā)生了變異。

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，基于核酸基因型的方法也被廣泛用于雙歧桿菌的檢測(cè)與鑒定。在細(xì)菌染色體中，16S rRNA，23S rRNA和5S rRNA基因較保守，其中16S rRNA基因普遍用于細(xì)菌的分類鑒定的依據(jù)，被認(rèn)為是細(xì)菌分類鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。研究者普遍使用16SrRNA基因序列對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，此外，基于雙歧桿菌16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)的特異性PCR引物，還可用于雙歧桿菌的快速鑒別和定量。相關(guān)研究表明雙歧桿菌屬的各個(gè)種或亞種的16S rRNA基因具有高度相似性，在鑒別雙歧桿菌屬內(nèi)的各個(gè)種或亞種中的分辨率較低為了克服這些技術(shù)的局限性，與單基因相比，依賴于多個(gè)保守分子標(biāo)記，例如clpC、dnaB、dnaG、dnaJ1、purF和rpoC基 因，還 有tuf、recA、hsp60、groEL、groES和編碼蘇氨酸-tRNA連接酶（thrS）的多基因方法被證明在物種區(qū)分及系統(tǒng)發(fā)育分析方面更可靠。但這些基因僅能應(yīng)用于有限的物種。近年來，全基因組測(cè)序技術(shù)正在逐漸取代傳統(tǒng)的微生物分型和表征方法，基于基因組水平可對(duì)雙歧桿菌物種進(jìn)行精確的分類、分型及系統(tǒng)發(fā)育分析，還可揭示了雙歧桿菌代謝機(jī)制及其與相應(yīng)宿主之間的聯(lián)系。

2 雙歧桿菌防治腸道疾病的作用機(jī)理

雙歧桿菌耐受過胃腸道不利因素后，與腸上皮細(xì)胞粘附并定植于大腸；雙歧桿菌代謝產(chǎn)物、腸道微生物及宿主腸道相互作用，保護(hù)腸道上皮屏障，調(diào)控腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康。

2.1 雙歧桿菌在腸道內(nèi)的分布區(qū)域雙歧桿菌在耐過胃腸道多種因素（如胃中的酸性pH值、胃酶、膽汁、胰酶）后，主要定植于哺乳動(dòng)物的結(jié)腸。連續(xù)給大鼠灌胃長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68 7d后，采集糞便并檢測(cè)其菌體情況，結(jié)果表明，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在胃和小腸中存活率均較低，在結(jié)腸和直腸中存活率較高并可在結(jié)腸中進(jìn)行增殖，這是由于結(jié)腸可以分泌碳酸氫鹽，使大腸液呈堿性（pH 8.3～8.4），并且結(jié)腸中適宜溫度及緩慢的運(yùn)動(dòng)給雙歧桿菌提供了一個(gè)適宜的棲息場(chǎng)所，這與Taverniti等研究的結(jié)果一致。

2.2 雙歧桿菌與腸道上皮細(xì)胞的相互作用腸上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，通過產(chǎn)生物理屏障及化學(xué)屏障將共生微生物和宿主免疫系統(tǒng)隔開，從而維持兩者在腸道內(nèi)的共生關(guān)系。另一方面，雙歧桿菌是哺乳動(dòng)物腸道中的共生菌，大部分附著于大腸的腸上皮細(xì)胞。雙歧桿菌物種多樣，即使同種雙歧桿菌，粘附機(jī)制也存在顯著的差異。在短雙歧桿菌UCC2003中，IVb型緊密粘附菌毛（Tad）是一種重要且保守的宿主定植因子；轉(zhuǎn)醛縮酶是兩歧雙歧桿菌表面蛋白質(zhì)，具有粘蛋白結(jié)合蛋白的作用，即促進(jìn)菌株對(duì)HT29細(xì)胞的粘附；兩歧雙歧桿菌ATCC15696胞外唾液酸酶與粘蛋白碳水化合物上唾液酸低聚糖和血型A抗原的α2,6鍵相互作用，增強(qiáng)了兩歧雙歧桿菌與黏膜表面的粘附；最近一項(xiàng)研究表明，由長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68菌毛產(chǎn)生的菌毛亞基蛋白（FimM）可作為一種新的表面粘附素，可介導(dǎo)BBMN68與粘蛋白、纖連蛋白和纖維蛋白原的粘附。

雙歧桿菌在粘附并定植于宿主腸道后，可促進(jìn)腸道健康。雙歧桿菌在豬腸上皮細(xì)胞系（PIE細(xì)胞）中的免疫調(diào)節(jié)活性研究表明，嬰兒雙歧桿菌MCC12和短雙歧桿菌MCC1274能夠增加PIE細(xì)胞中干擾素-β（IFN-β）的產(chǎn)生，以響應(yīng)豬輪狀病毒感染。同時(shí)，在輪狀病毒感染之前用IFN-β治療新生小牛和小豬，可抑制病毒復(fù)制并降低疾病嚴(yán)重程度。此外，兩種雙歧桿菌都增加了趨化因子（CXCL10）和白細(xì)胞介素（IL-6）的表達(dá)。這表明，雙歧桿菌菌株通過模式識(shí)別受體信號(hào)來調(diào)節(jié)豬腸道上皮細(xì)胞的輪狀病毒免疫反應(yīng)。在另一項(xiàng)研究中，短雙歧桿菌MCC-117能夠有效調(diào)節(jié)豬腸上皮（PIE）細(xì)胞系中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC)引發(fā)的炎癥反應(yīng)。雙歧桿菌還可刺激回腸上皮中Toll樣受體2（TLR-2）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)并阻斷細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，通過該分子機(jī)制減少黏膜損傷并保持腸道完整性。

2.3 雙歧桿菌與腸道其他微生物的相互作用腸道菌群是一個(gè)包含多種微生物集合的自然環(huán)境。不同物種之間通過生長(zhǎng)空間、結(jié)合受體位點(diǎn)、獲取胃腸道營(yíng)養(yǎng)資源的競(jìng)爭(zhēng)等來決定了腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)。雙歧桿菌通過菌株特異性拮抗機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性排除病原體。長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種和嬰兒亞種可以通過阻止盲腸中志賀毒素的產(chǎn)生或志賀毒素從腸腔轉(zhuǎn)移到血液中來防止大腸桿菌O157:H7的致命感染。嗜熱雙歧桿菌RBL67可導(dǎo)致沙門氏菌毒力基因表達(dá)失衡從而降低其對(duì)宿主的感染率，還可抑制沙門氏菌鞭毛基因的表達(dá)來降低其運(yùn)動(dòng)性從而抑制沙門氏菌的定植。

飼喂雙歧桿菌可改變宿主腸道菌群的組成。給小鼠灌胃兩歧雙歧桿菌MIMBb23sg 5d后，對(duì)小鼠腸道進(jìn)行微生物組進(jìn)行分析。結(jié)果表明，兩種阿克曼氏菌的豐度增加了。小型豬飼喂嗜熱雙歧桿菌RBL67和低聚果糖(FOS)發(fā)現(xiàn)，豬盲腸和結(jié)腸中雙歧桿菌數(shù)量顯著增加。一項(xiàng)研究評(píng)估了長(zhǎng)雙歧桿菌BB536對(duì)具有15種人類腸道微生物群的無菌小鼠腸道環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充長(zhǎng)雙歧桿菌BB536菌株可改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改變腸腔內(nèi)生物素和丁酸鹽的代謝。

2.4 雙歧桿菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)與宿主相互作用雙歧桿菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸、吲哚、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外蛋白、細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可抑制病原體粘附，保護(hù)腸道上皮屏障，并增強(qiáng)緊密連接的表達(dá)。

短鏈脂肪酸（SCFA）是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維和抗性淀粉的最終產(chǎn)物，包括醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等，是維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要代謝物。首先，醋酸是腸道中最豐富的SCFA，由糖酵解產(chǎn)生的乙酰輔酶A產(chǎn)生；有研究表明，長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種JCM1217T、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種157F、長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種NCC2705內(nèi)的果糖及其ATP結(jié)合盒ABC型碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在很大程度上促成了醋酸鹽的產(chǎn)生，醋酸鹽在宿主結(jié)腸上皮細(xì)胞中介導(dǎo)抗凋亡和抗炎反應(yīng)，從而保護(hù)小鼠免受O157誘導(dǎo)的死亡。丙酸鹽作為肝臟糖異生的前體，影響細(xì)胞分化，對(duì)腸道炎癥和癌癥發(fā)展具有潛在的促進(jìn)健康的作用。丁酸鹽是結(jié)腸上皮細(xì)胞的首選能量來源，有助于維持腸道屏障功能，并具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性。利用菊粉型果聚糖(ITF)和阿拉伯木聚糖低聚糖(AXOS)等益生元來刺激結(jié)腸中雙歧桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)也增加了結(jié)腸細(xì)菌中丁酸鹽的產(chǎn)生。

吲哚是含有色氨酸酶的細(xì)菌產(chǎn)生的，而腸道中共生微生物群有助于在腸腔中產(chǎn)生大量吲哚，該類物質(zhì)可促進(jìn)結(jié)腸內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接和粘附連接相關(guān)分子的表達(dá)從而增強(qiáng)結(jié)腸上皮屏障功能。長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種利用人乳寡糖可產(chǎn)生色氨酸代謝物吲哚-3-乳酸(ILA)，吲哚-3-乳酸(ILA)通過激活腸上皮細(xì)胞中的芳烴受體(AhR)和下游核因子紅細(xì)胞衍生2樣2(Nrf2)通路來降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）的產(chǎn)生，從而降低腸上皮細(xì)胞的炎癥。

細(xì)胞外囊泡是由細(xì)菌釋放的一種脂質(zhì)雙層納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外顆粒，主要由蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、脂多糖組成。一項(xiàng)研究中，兩歧雙歧桿菌LMG13195的細(xì)胞外囊泡可激活樹突狀細(xì)胞以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)比干擾素γ（IFNγ）、TNF-α和白細(xì)胞介素-17（IL-17）促炎細(xì)胞因子更高水平的白細(xì)胞介素-10（IL-10），結(jié)果表明雙歧桿菌LMG13195細(xì)胞外囊泡可作為過敏原特異性免疫治療的潛在佐劑。另一項(xiàng)研究證實(shí)了是由長(zhǎng)雙歧桿菌KACC91563胞外囊泡分泌的胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白通過肥大細(xì)胞特異性凋亡有效緩解食物過敏癥狀。此外，長(zhǎng)雙歧桿菌NCC2705胞外囊泡還分泌粘蛋白結(jié)合蛋白，該蛋白可以粘附到宿主黏膜表面從而促進(jìn)長(zhǎng)雙歧桿菌在胃腸道中的定植。

細(xì)菌素是由核糖體合成的抗菌肽，可抑制腸道病原體，促進(jìn)腸道健康。雙歧桿菌細(xì)菌素具有潛在的重要意義和價(jià)值，但由于雙歧桿菌培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)方式的影響，只有少數(shù)雙歧桿菌細(xì)菌素進(jìn)行深入研究。研究表明雙歧桿菌素B由兩歧雙歧桿菌NCFB1454產(chǎn)生，對(duì)李斯特菌、腸球菌、葡萄球菌、梭菌和芽孢桿菌具有抗菌活性；嬰兒雙歧桿菌BCRC14602產(chǎn)生的雙歧素I，其抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌如鏈球菌、葡萄球菌和梭狀芽孢桿菌，以及革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌等具有抑制作用。

2.5 雙歧桿菌調(diào)控腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的可能機(jī)制雙歧桿菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，Kato S等研究發(fā)現(xiàn)，兩歧雙歧桿菌G9-1能夠抑制大腸桿菌的過度增殖并恢復(fù)空腸絨毛長(zhǎng)度，改善菌群生態(tài)失調(diào)，進(jìn)而緩解腹瀉癥狀。另一研究也表明BBG9-1可顯著抑制5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門豐度的降低和擬桿菌門豐度的相應(yīng)增加。這表明，BBG9-1通過減少生態(tài)失調(diào)來抑制繼發(fā)性炎癥，從而預(yù)防5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腸道黏膜炎。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)雙歧桿菌胞外分泌蛋白即長(zhǎng)雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白是一種抗菌肽，具有抗菌活性；通過16SrRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果顯示，經(jīng)長(zhǎng)雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白處理后，厚壁菌門相對(duì)豐度增加而變形菌門的相對(duì)豐度降低。結(jié)果表明，長(zhǎng)雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白參與了腸道微生物群的調(diào)節(jié)。

3 雙歧桿菌在家畜疾病防治中的研究和應(yīng)用

腹瀉的發(fā)生可由病原微生物感染引起，同時(shí)，應(yīng)激、日糧、衛(wèi)生條件等因素也會(huì)改變胃腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病原菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，有益菌減少。在動(dòng)物腹瀉相關(guān)疾病的預(yù)防中，常在飼料添加劑中添加雙歧桿菌等益生菌，提高動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率、改善機(jī)體免疫、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。

3.1 防治畜禽腹瀉腹瀉是由于細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種因素引起腸道感染的一種臨床癥狀，可導(dǎo)致幼齡哺乳動(dòng)物嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)紊亂并繼發(fā)一系列的并發(fā)癥后死亡，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Cizeikiene D等研究發(fā)現(xiàn)B.pseudolongum DSM 20099和B.animalis DSM 20105菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸、乙酸、抗菌肽等化合物，可降低細(xì)胞質(zhì)的pH值從而抑制病原微生物的生長(zhǎng)。同時(shí)，許多研究也表明,雙歧桿菌可緩解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC、鼠傷寒沙門菌引起的腹瀉。

Kang JY等研究證明長(zhǎng)雙歧桿菌可增加干擾素IFN-α、IFN-β的水平和干擾素誘導(dǎo)型抗病毒效應(yīng)物的基因表達(dá)從而在體外和體內(nèi)有效抑制輪狀病毒復(fù)制。另一項(xiàng)研究表明長(zhǎng)雙歧桿菌BORI細(xì)胞提取物中的低分子量和非蛋白質(zhì)成分在抗輪狀病毒作用中發(fā)揮重要作用。

3.2 促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育在動(dòng)物腹瀉相關(guān)疾病的預(yù)防中，許多研究表明，新生犢牛和仔豬口服假長(zhǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌或B.globosum可以使體重增加、提高飼料轉(zhuǎn)化率并降低腹瀉發(fā)生的頻率及死亡率。Abdel-Moneim AE和El-Moneim AEEA的研究都評(píng)估了卵內(nèi)注射雙歧桿菌對(duì)肉雞性能、回腸組織形態(tài)測(cè)定的影響，結(jié)果都表明所有治療組的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化率都有顯著改善及回腸組織形態(tài)中絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度比值顯著升高。

大量文獻(xiàn)也證明了雙歧桿菌可以提高機(jī)體免疫力，其中，Hickey A等確定短雙歧桿菌胞外多糖通過阻斷樹突細(xì)胞成熟和樹突細(xì)胞介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)激活以實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)免疫逃避和宿主-微生物共生。

4 結(jié)語與展望

眾多研究表明，雙歧桿菌具有促進(jìn)腸道健康、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和提高免疫力等生理功能，但在家畜產(chǎn)業(yè)中，雙歧桿菌的研究多集中于對(duì)腸道疾病治療和促進(jìn)機(jī)體發(fā)育等方面，多數(shù)以小鼠模型展開研究，其結(jié)果與臨床應(yīng)用尚有較大的差距。關(guān)于雙歧桿菌和反芻動(dòng)物乳房炎、營(yíng)養(yǎng)代謝病或病原菌具體作用機(jī)制的研究較少，特別是不同生理功能之間是否存在網(wǎng)絡(luò)互作還需進(jìn)一步探索。隨著我們加深對(duì)雙歧桿菌生理功能和作用機(jī)制的研究，必將推動(dòng)雙歧桿菌的資源利用和產(chǎn)業(yè)開發(fā)。