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    NFC楊梅汁加工及貯藏環(huán)節(jié)微生物群落多樣性分析

    2022-11-18 02:54:20宣曉婷鄧文藝尚海濤林旭東凌建剛
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年20期
    關(guān)鍵詞:葡糖貯藏期桿菌屬

    宣曉婷,崔 燕,程 煥,鄧文藝,尚海濤,林旭東,張 鐵,凌建剛,

    (1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,浙江寧波 315400;2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058;3.湖南一品東方生物科技有限公司,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

    楊梅(Myrica rubra Sieb.etZucc.)主產(chǎn)于長(zhǎng)江中下游以南地區(qū),因其風(fēng)味獨(dú)特濃郁、酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高(富含花色苷、類黃酮、酚酸類等活性成分)而深受消費(fèi)者喜愛。楊梅采收期主要集中在梅雨高溫季節(jié),且易受到機(jī)械損傷、微生物侵染等問(wèn)題而導(dǎo)致品質(zhì)下降,甚至失去其商品價(jià)值。因此楊梅產(chǎn)業(yè)亟需尋找一種減少采后損失、提高產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的技術(shù)手段。近年來(lái),隨著大眾消費(fèi)者對(duì)健康和營(yíng)養(yǎng)的需求轉(zhuǎn)變,非濃縮還原果汁(Not-from-concentrate juice,NFC)逐漸受到廣大消費(fèi)者的喜愛。NFC果汁在加工過(guò)程中溫度低、時(shí)間短,所以較傳統(tǒng)的濃縮還原果汁能更好地保留新鮮水果中原有的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味。將楊梅鮮果加工成高品質(zhì)的NFC楊梅汁可以有效地解決難運(yùn)輸、短銷售期、短貯藏期等難點(diǎn)[1]。

    超高壓技術(shù)(High Hydrostatic Pressure,HHP)是NFC果汁加工過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),作為一種新型的食品非熱加工技術(shù),它的作用機(jī)理是通過(guò)水為傳壓介質(zhì),均勻地施壓于果汁物料,可以達(dá)到殺菌、鈍酶、改善品質(zhì)等效果,且很好地保留了果汁原有的色香味和營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì),因此超高壓技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單一型果汁[2-3]、復(fù)合型果汁[4]和果蔬復(fù)合汁[5],目前關(guān)于超高壓控制果汁中微生物生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期等研究已有相關(guān)報(bào)道[3,6],Stinco C M等人[6]研究發(fā)現(xiàn)超高壓(450,600 MPa)處理胡蘿卜濁汁5 min可延長(zhǎng)其貨架期至14周;Blaszczak W等人[3]也發(fā)現(xiàn)400~600 MPa使得黑莓汁的菌落總數(shù)降至檢測(cè)限值(1 CFU/mL)以下。關(guān)于加工環(huán)節(jié)、貯藏及超高壓處理對(duì)NFC果汁中微生物多樣性變化的研究極少,因此開展楊梅汁加工、貯藏及超高壓處理對(duì)其微生物組的研究非常必要。

    早期的微生物群落多樣性的研究主要采用純培養(yǎng)、理化鑒定等技術(shù)手段,但對(duì)于自然環(huán)境中出現(xiàn)的不可培養(yǎng)或是無(wú)法鑒定的微生物則束手難測(cè)[7-8]。隨著研究技術(shù)手段的不斷更替,免培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,包括溫度梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳[9-10]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[11-12]、熒光原位雜交[13]等。免培養(yǎng)技術(shù)增加了可鑒定的微生物種類,但距離全面建立微生物種類的數(shù)據(jù)庫(kù)還存在很大的差距。因此,作為第二代測(cè)序技術(shù)的高通量測(cè)序技術(shù)有效克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的局限性,同時(shí)因其能同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序,精度高、無(wú)偏性等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于快速鑒定微生物多樣性和鑒別新微生物種群[14]。目前,基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)以羅氏公司454測(cè)序技術(shù)、Illumina公司Solexa測(cè)序技術(shù)和ABI公司的Solid測(cè)序技術(shù)為代表,廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各類食品中的微生物多樣性,如發(fā)酵乳品[14-15]、酒類[16-18]、調(diào)味料[19-20]、水產(chǎn)品[21]、蔬菜[22]等,但在果汁領(lǐng)域的應(yīng)用極少,僅在哈密瓜汁、櫻桃等有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]。

    基于高通量測(cè)序方法對(duì)楊梅汁在加工環(huán)境、貯藏期、超高壓處理過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析,更加全面地展現(xiàn)楊梅汁在全產(chǎn)業(yè)鏈中微生物多樣性及演替變化,為更好地控制楊梅汁中微生物奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    東魁楊梅,寧波寧海善福果蔬專業(yè)合作社提供,選擇新鮮無(wú)蟲蛀、無(wú)腐爛的成熟果實(shí),清洗去除污垢雜質(zhì),原料冷凍貯存。

    PCR產(chǎn)物純化試劑盒,美國(guó)Thermo公司提供;PCR擴(kuò)增試劑及引物,TaKaRa公司提供;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,AXYGEN公司提供;Phusion R High-Fidelity PCR Master,美國(guó)New England Biolabs公司提供;其他試劑,均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

    超高壓設(shè)備,北京速原中天有限公司產(chǎn)品;NovaSeq6000 DNA測(cè)序儀,德國(guó)Illumina公司產(chǎn)品;GeneAmp R 9700 PCR儀,美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng),美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽,美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 工藝流程楊梅→挑選→清洗→去核→榨汁→過(guò)濾→超高壓殺菌→楊梅汁。

    1.2.2 操作要點(diǎn)

    (1)原料選擇和清洗。選擇新鮮無(wú)蟲蛀、無(wú)腐爛的成熟果實(shí),清洗去除污垢雜質(zhì)。

    (2)去核。楊梅在榨汁前進(jìn)行人工去核,楊梅果肉備用。

    (3)榨汁和過(guò)濾。為了最大限度地保留果蔬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),將清洗后去核的楊梅在低溫下進(jìn)行榨汁,然后用紗布進(jìn)行過(guò)濾。

    (4)超高壓處理。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7101—2015,并基于超高壓楊梅汁的菌落總數(shù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確立超高壓參數(shù)為壓力500 MPa,保壓時(shí)間5 min,設(shè)備升壓時(shí)間為3 min,泄壓時(shí)間3~5 s。將樣品置于超高壓滅菌倉(cāng)中進(jìn)行處理,處理結(jié)束后,將樣品取出備用。

    1.2.3 組別的設(shè)置

    (1)加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以楊梅原果為空白對(duì)照組(A1),選取重要加工環(huán)節(jié)(榨汁和殺菌)的楊梅樣品分別設(shè)為A2和A3組,對(duì)比3組加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組(Group 1)楊梅樣品中微生物菌群組成。

    (2)貯藏期試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以超高壓殺菌后的楊梅汁為對(duì)照組(A3),在4℃下貯藏1,2,3周的楊梅汁樣品,分別設(shè)為A4,A5,A6組,對(duì)比4組貯藏期試驗(yàn)組(Group 2)楊梅汁樣品中細(xì)菌群落組成。

    (3)超高壓試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以超高壓殺菌(500 MPa/5 min)后的楊梅汁為對(duì)照組(A3),設(shè)500 MPa/10 min超高壓試驗(yàn)組為A7,500 MPa/5 min+5 min超高壓試驗(yàn)組為A8(即反復(fù)升泄壓1次)。對(duì)比3組超高壓試驗(yàn)組(Group 3)楊梅汁樣品中細(xì)菌群落組成。

    1.2.4 基因組DNA抽提

    基于CTAB/SDS方法提取樣品中的總基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA濃度和純度。根據(jù)濃度,用無(wú)菌水將DNA稀釋至1 ng/μL。

    1.2.5 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    參考張敏等人[14]和楊勝平等人[21]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。全部樣品重復(fù)3次,將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè),選擇400~450 bp亮主條的樣品進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

    擴(kuò)增樣品混合后采用GeneJET Gel Extraction Kit純化,在超微量紫外分光光度計(jì)上精確定量后,等量混合在Illumina PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,PCR擴(kuò)增及測(cè)序工作由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    基于3次重復(fù)試驗(yàn)所得的原始數(shù)據(jù),采用Trimmomatic、Usearch 10.0軟件處理進(jìn)行分類單元OTU(Operational taxonomic unit)聚類分析和物種分類學(xué)分析,基于OTU聚類分析結(jié)果,通過(guò)QIIME 1.9.1軟件對(duì)OTU進(jìn)行Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)等多樣性指數(shù)分析,以及對(duì)測(cè)序深度the Good's coverage的檢測(cè)?;诜诸悓W(xué)信息,可以在門和屬分類水平上進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)稀釋性曲線可得出測(cè)序深度情況。根據(jù)樣品間豐度相似性聚類,將聚類后數(shù)據(jù)表示在Heatmap圖中,通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)可視化反映樣品間在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品序列數(shù)的特點(diǎn)

    通過(guò)細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序,加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組(Group 1)3個(gè)樣品共產(chǎn)生191 952個(gè)序列標(biāo)簽,平均長(zhǎng)度為382.45 bp,所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU分類,總共聚成296個(gè)OTU。貯藏試驗(yàn)組(Group 2)4個(gè)樣品共產(chǎn)生249 131個(gè)序列標(biāo)簽,平均長(zhǎng)度為383.75 bp,OTU分類共聚成497個(gè)OTU。超高壓試驗(yàn)組(Group3)3個(gè)樣品共產(chǎn)生184 246個(gè)序列標(biāo)簽,平均長(zhǎng)度為381.40 bp,OTU分類共聚成332個(gè)OTU。

    2.2 樣品菌群多樣性分析

    不同加工環(huán)節(jié)楊梅樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性見表1,楊梅汁貯藏期樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性見表2,不同超高壓處理?xiàng)蠲分瓨悠返男畔?、序列豐度及微生物多樣性見表3,細(xì)菌群落基于UniFrac的稀釋曲線見圖1。

    表1 不同加工環(huán)節(jié)楊梅樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性

    表2 楊梅汁貯藏期樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性

    表3 不同超高壓處理?xiàng)蠲分瓨悠返男畔?、序列豐度及微生物多樣性

    試驗(yàn)將不同樣品相似度為97%的OTU進(jìn)行聚類分析,評(píng)價(jià)3組試驗(yàn)組樣品間的微生物菌群相似性,通過(guò)稀釋曲線(Rarefaction curve)體現(xiàn)樣品的測(cè)序深度情況[22-25]。稀釋曲線使用97%相似度的OTU,用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣品中物種的豐富度[26]。由圖1可知,稀釋曲線逐漸趨于平緩,表明測(cè)序結(jié)果合理,且能反映樣品中物種的豐富度和均勻度,其中曲線部分在橫軸上的范圍大,說(shuō)明樣品中物種豐度較高。

    圖1 細(xì)菌群落基于UniFrac的稀釋曲線

    細(xì)菌群落的多樣性分析(Alpha-diversity)可以反映微生物菌群的豐度和多樣性,包括Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和覆蓋率。由表1可知,加工環(huán)節(jié)中殺菌后楊梅汁中細(xì)菌Shannon指數(shù)明顯高于其他組,說(shuō)明殺菌后楊梅汁中微生物群落種群差異性較大。從OTU數(shù)可知,殺菌后楊梅汁的數(shù)值最高,其次是楊梅原料組,榨汁組最少。樣品的Chao1指數(shù)有與OTU相類似的結(jié)果,這是由于Chao1算法通常是估算樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù),在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。隨著加工環(huán)節(jié)的進(jìn)程,樣品的Simpson指數(shù)逐漸降低,Simpson指數(shù)是用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù),其數(shù)值越大,說(shuō)明隨著楊梅汁的加工,樣品的群落多樣性越低。有研究報(bào)道,超高壓處理會(huì)導(dǎo)致菌群相對(duì)豐度和多樣性降低,且對(duì)不同微生物的影響也不同[27-28],研究結(jié)果與之相一致。此外,楊梅汁樣品的覆蓋率均大于99%,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以代表樣品中微生物的真實(shí)情況。表2和表3顯示超高壓處理組和貯藏組樣品OTU沒有明顯變化規(guī)律,說(shuō)明在不同超高壓處理和貯藏期過(guò)程中樣品的微生物群落種群差異性較小。Toledo D A J等人[23]研究了超高壓對(duì)櫻桃貯藏期間微生物多樣性變化,發(fā)現(xiàn)其隨著貯藏期到第60天顯著下降,且600 MPa壓力下櫻桃中微生物多樣性明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏期過(guò)程中的樣品微生物群落種群差異性較小,猜測(cè)可能的原因是由于貯藏時(shí)間較短,其微生物多樣性未發(fā)現(xiàn)顯著變化。由表3結(jié)果顯示隨著增壓次數(shù)增加,楊梅汁微生物多樣性并未發(fā)生顯著降低,汪蘭等人[29]研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理具有較好的滅菌效果且隨著增壓次數(shù)的增加,菌落總數(shù)也有不同程度的減少,但對(duì)于微生物多樣性的影響研究目前暫未報(bào)道。

    2.3 樣品細(xì)菌群落門和屬水平分布

    楊梅汁樣品門(A,C,D)和屬(B,E,F)水平菌群分布圖見圖2。

    圖2 楊梅汁樣品門(a,c,d)和屬(b,e,f)水平菌群分布圖

    3組試驗(yàn)中,楊梅汁的3個(gè)細(xì)菌門被鑒別,它們分別是變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、未分類菌群。對(duì)楊梅汁中主要組成的3個(gè)門進(jìn)行門水平菌群比例分布繪圖。由圖2(a)~(c)可知,所有楊梅汁樣品均以變形菌門為最占優(yōu)勢(shì)的菌群門,占細(xì)菌總序列比值均超過(guò)55%?;诓煌M試驗(yàn)進(jìn)一步分析表明,榨汁和殺菌工藝降低了樣品中變形菌門比例,而藍(lán)藻菌門比例上升(由5.53%分別上升至40.46%和28.80%)。隨著貯藏期的延長(zhǎng),樣品中優(yōu)勢(shì)菌群門變形菌門占總序列比值有所上升,說(shuō)明貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群門以變形菌門為主。此外,隨著超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng),樣品中變形菌門占總序列的比例也在上升,且循環(huán)超高壓處理方式會(huì)提高其占比。研究結(jié)果表明超高壓處理會(huì)導(dǎo)致菌群相對(duì)豐度和多樣性改變,且對(duì)不同微生物的影響也不同,這與Perez Pulido R等人[27-28]的研究結(jié)果相一致。

    由圖2(d)~(f)可知,3組試驗(yàn)組中的微生物菌群的主要種屬相差不大,但占比存在顯著差異。楊梅汁樣品中微生物菌群以葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、藍(lán)藻菌屬(Cyanobacteria_norank)、假單胞細(xì)菌屬(Pseudomonas)、Mitochondria-norank、伯克氏菌屬(Burkholderia-Paraburkholderia)為主要細(xì)菌種屬。從加工環(huán)節(jié)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),榨汁環(huán)節(jié)降低了樣品中葡糖桿菌屬(53.44%降低至22.33%),而藍(lán)藻菌屬和醋酸桿菌屬顯著升高,分別升高至40.46%和19.85%;殺菌環(huán)節(jié)有相類似的變化規(guī)律,其中藍(lán)藻菌屬和醋酸桿菌屬顯著升高,分別升至28.80%和25.83%。從貯藏組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),楊梅汁樣品在貯藏第1周,原優(yōu)勢(shì)菌種屬由藍(lán)藻菌屬變?yōu)槠咸菞U菌屬和醋酸桿菌屬,其占總序列比分別為35.87%和30.28%;隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),藍(lán)藻菌屬占比降低至12.32%,而葡糖桿菌屬和醋酸桿菌屬占比分別升至36.48%和32.18%。從超高壓試驗(yàn)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),500 MPa/5 min處理組樣品中細(xì)菌以藍(lán)藻菌屬(28.88%)、醋酸桿菌屬(27.01%)和葡糖桿菌屬(24.40%)為主要細(xì)菌種屬,總占比達(dá)80.29%;隨著超高壓處理時(shí)間延長(zhǎng)至10 min,樣品中細(xì)菌以醋酸桿菌屬(29.29%)、藍(lán)藻菌屬(27.08%)和葡糖桿菌屬(24.94%)為主要細(xì)菌種屬,總占比達(dá)81.31%;較直接泄壓的超高壓處理方式,反復(fù)泄壓的超高壓處理方式的樣品中細(xì)菌以葡糖桿菌屬(34.11%)、醋酸桿菌屬(28.64%)和藍(lán)藻菌屬(22.90%)為主要細(xì)菌種屬,總占比達(dá)85.65%。

    應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù),檢測(cè)果蔬中微生物多樣性及相對(duì)豐度的研究相對(duì)較少。Wang L等人[30]研究了超高壓對(duì)蘆筍貯藏期微生物多樣性的影響,研究發(fā)現(xiàn)蘆筍中微生物以變形菌門(泛菌和假單胞菌屬)、厚壁菌門(乳球菌和腸球菌)等為優(yōu)勢(shì)菌群。在蘆筍貯藏期初期,超高壓處理降低了假單胞菌的相對(duì)豐度但同時(shí)腸桿菌屬顯著增加。后續(xù)Toledo D A J等人[31]又研究了超高壓對(duì)櫻桃中微生物多樣性的影響以及貯藏期間微生物的演替。微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)櫻桃中變形菌(Proteobacteria)的相對(duì)豐度最高,而葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)是其中的優(yōu)勢(shì)菌屬。在60 d的貯藏過(guò)程中葡糖桿菌屬一直占有主導(dǎo)地位,這與研究的結(jié)果相類似。葡糖桿菌屬是一種好氧非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌,廣泛分布于鮮花、水果等高糖環(huán)境中,也能在蘋果酒、葡萄酒和啤酒等飲料環(huán)境中生長(zhǎng)。雖然這種菌對(duì)人類沒有致病性,但會(huì)導(dǎo)致水果腐爛和褐變[32]。葡糖桿菌和醋酸桿菌具有氧化代謝特性,可以氧化糖、有機(jī)酸和醇等部分有機(jī)小分子[33-34]。當(dāng)乙醇存在時(shí),葡糖桿菌和醋酸桿菌會(huì)產(chǎn)生乙酸,造成乙酸腐敗。

    2.4 樣品細(xì)菌群落相似性分析

    基于UniFrac的聚類樹分析和主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),試驗(yàn)將不同樣品相似度為97%的OTU進(jìn)行聚類分析3組試驗(yàn)組各自樣品間的微生物群落相似性,通過(guò)Heatmap圖可視化展現(xiàn)不同樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性[31]。

    Group 1樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)見圖3,Group 2樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)見圖4,Group 3樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)見圖5,細(xì)菌群落基于UniFrac的主成分分析見圖6。

    圖3 Group 1樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)

    圖4 Group 2樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)

    圖5 Group 3樣品中細(xì)菌群落熱圖分析(a)和層次聚類分析(b)

    圖6 細(xì)菌群落基于UniFrac的主成分分析

    圖3(a)、圖4(a)和圖5(a)分別為加工環(huán)節(jié)、貯藏期、超高壓處理對(duì)楊梅中微生物群落影響熱圖分析,熱圖通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映樣品群落相似性,其中紅色代表高豐度的細(xì)菌群落,藍(lán)色代表低豐度的細(xì)菌群落。從圖中可以看出楊梅汁樣品中微生物菌群均以葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)和藍(lán)藻菌屬(Cyanobacteria-norank)為排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬。由圖2(b)可知,加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組樣品共聚成兩類,第1類為空白對(duì)照組,第2類為榨汁和殺菌組樣品,這就說(shuō)明加工環(huán)節(jié)改變了楊梅樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu),增加了其差異性。圖3(b)為貯藏期楊梅汁樣品微生物群落動(dòng)態(tài)變化的層次聚類分析。由圖3(b)可知,樣品共聚成3類,第1類為對(duì)照組和貯藏1周后的楊梅汁樣品,第2類和第3類分別為貯藏2周和3周后的楊梅汁樣品,說(shuō)明貯藏中后期楊梅汁樣品中的微生物群落差異性增加。圖4(b)為樣品中細(xì)菌群落層次聚類分析,所有超高壓處理樣品共聚成2類,第1類是500 MPa/5 min處理組和500 MPa/5 min+5 min組,第2類是500 MPa/10 min試驗(yàn)組樣品,結(jié)果表明超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)改變楊梅汁樣品中微生物多樣性,而與單循環(huán)超高壓處理相比,反復(fù)循環(huán)超高壓處理后楊梅汁微生物菌群結(jié)構(gòu)更接近對(duì)照組試驗(yàn)。

    PCA主成分分析是一種多元統(tǒng)計(jì)方法,通過(guò)正交變換將一組可能相關(guān)變量降維轉(zhuǎn)換為一組稱為主成分的線性不相關(guān)變量的值,當(dāng)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)80%時(shí),即代表基本包含樣品的信息。樣品組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近。由圖6可知,較榨汁加工試驗(yàn)組,殺菌試驗(yàn)組與空白對(duì)照組距離更遠(yuǎn),說(shuō)明殺菌后楊梅汁中的微生物差異性增加;貯藏3周試驗(yàn)組比貯藏1周試驗(yàn)組距離更遠(yuǎn),說(shuō)明隨著貯藏期的延長(zhǎng),楊梅汁中微生物群落差異性增加;超高壓試驗(yàn)組中,延長(zhǎng)處理時(shí)間和改變泄壓方式均增加了楊梅汁中的微生物差異性,且前者的影響較后者更大。

    3 結(jié)論

    綜上所述,楊梅汁中微生物多樣性在加工過(guò)程中呈逐步下降趨勢(shì),但在不同超高壓處理和貯藏過(guò)程中楊梅汁的微生物群落種群差異性較小。在加工過(guò)程中,楊梅汁以變形菌門為主,其中榨汁和殺菌工藝降低了楊梅汁中變形菌門比例,而隨著貯藏期的延長(zhǎng)、超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)或者循環(huán)超高壓處理方式會(huì)提高樣品中變形菌門比例。在屬水平上,楊梅汁中微生物以葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、藍(lán)藻菌屬(Cyanobacterianorank)等為優(yōu)勢(shì)菌屬。在加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組以藍(lán)藻菌屬為主;貯藏期試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)菌種屬由藍(lán)藻菌屬變?yōu)槠咸菞U菌屬和醋酸桿菌屬。通過(guò)探究楊梅汁在加工、貯藏和超高壓殺菌環(huán)節(jié)中微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化,為進(jìn)一步控制楊梅汁加工貯藏過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的微生物安全性提供依據(jù)和參考。

    此外,有研究證實(shí)超高壓會(huì)導(dǎo)致微生物進(jìn)入亞致死狀態(tài),這是由于殺菌不徹底、微生物脅迫耐受性等因素導(dǎo)致食源性致病菌出現(xiàn)正常和死亡以外的第3種生理狀態(tài)——亞致死損傷狀態(tài),在產(chǎn)品貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中,一旦處于亞致死狀態(tài)的致病菌處于適宜的環(huán)境條件下,亞致死菌能夠自我修復(fù)并且恢復(fù)到正常的狀態(tài),一旦進(jìn)入人體便會(huì)存在潛在危害,給食品安全保障帶來(lái)嚴(yán)重隱患,未來(lái)將針對(duì)存在亞致死菌的食品,對(duì)其在貯藏期間微生物多樣性變化的內(nèi)在規(guī)律開展更深入的研究。

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