基于高通量測序技術研究栽培蒼術根際土壤微生物變化

徐 燕 ?？》?陳利軍 王世強 董忠民,2 王喆之

（1西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，710119，中國陜西西安；2圣瑪麗大學生物系，B3H3C3，加拿大新斯科舍哈利法克斯）

蒼術為菊科多年生植物，分為茅蒼術[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.]和北蒼術[Atraetylodes chinensis(DC.)Koidz.]，主要分布于我國東北、華北及安徽、江蘇、河南、陜西和湖北等地。蒼術的干燥根莖可入藥，具有燥濕健脾和祛風散寒的功效，臨床上用于治療脘腹脹滿、濕阻中焦、風寒感冒、風濕痹痛和眼目昏澀等癥。多地地方植物志對其均有收錄，《中華人民共和國藥典》[1]也將其收入書中。

隨著自然環(huán)境的破環(huán)，野生蒼術資源越來越少，人工種植蒼術成為發(fā)展趨勢[2]。而目前人工種植蒼術仍存在一定的技術問題。在獲得成熟的根莖入藥之前，蒼術需要較長的生長年限，種植過程中病蟲害頻發(fā)和藥材質量下降已成為影響蒼術人工種植的主要問題。研究[3]發(fā)現(xiàn)，隨著蒼術種植年限的增加，病害逐漸增多，影響產(chǎn)量和質量。已有研究[4]表明，長期種植同一作物會改變微生物的群落結構以及土壤理化性質，使得土壤傳染性病蟲害加重，出現(xiàn)藥用植物化感自毒作用等現(xiàn)象。土壤微生物能夠分解土壤中的有機質，釋放各種營養(yǎng)元素，從而給作物提供較好的土壤環(huán)境，通常土壤質量的好壞可由土壤微生物的數(shù)量、功能和結構來反映，土壤微生物的變化也揭示了土壤質量的變化。蒼術栽培多年后病害通常會增加，但病害菌的來源尚不清楚。據(jù)報道[5]，蒼術的一些病害是由病害孢子在入冬時埋藏于土壤，第2年入侵植株從而引發(fā)病害，比如蒼術葉斑病。

微生物數(shù)量龐大，結構復雜多樣，在傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法中，較常用到的是平板培養(yǎng)法、生物化學方法、生物標記法和分子生物學方法[6-7]。但因鑒定出的微生物種類不全且操作復雜，以上研究方法并不能很好地對微生物進行研究。相較于傳統(tǒng)的研究方法，高通量測序因具有高覆蓋度、高靈敏度和高準確性的特點而在各領域得到了廣泛的應用[8]。利用高通量測序技術對栽培3年后的蒼術根際土壤微生物進行研究，初步確定蒼術種植前后根際土壤微生物的變化情況，探討蒼術根際土壤微生物的變化與蒼術病害間的關系，為種植中的病害頻發(fā)問題的解決提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年8月在陜西省柞水縣下梁鎮(zhèn)北蒼術基地（109°10'52.57"E，33°39'52.704"N）采集試驗材料?；啬昃邓?42mm，年日照時數(shù)1860.2h，采集地人工起壟，排水性能良好，土壤濕度適中，田間管理主要是定期進行人工除草，在7-8月高濕高溫季節(jié)，基地的蒼術時有病害發(fā)生。土壤材料為同一地塊內(nèi)以“S”形方法分別采集5份土壤（深10～30cm）進行混合，裝入無菌自封袋中，低溫避光條件下帶回實驗室。種植蒼術3年的根際土壤標記為ZX3，未種植土壤標記為ZXCK，每個處理組進行3次生物學重復，ZX3.1、ZX3.2、ZX3.3為樣品 ZX3的 3個重復，ZXCK1.1、ZXCK1.2、ZXCK1.3為樣品ZXCK的3個重復，所有土壤過2mm篩后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤基因組DNA的提取和純化 采用天根生化科技（北京）有限公司的土壤基因組DNA提取試劑盒，參照說明書提取土壤微生物的DNA。使用天根生化科技（北京）有限公司的DNA回收試劑盒對電泳產(chǎn)物（25V，8h）進行回收。使用Nordrop 2000測定DNA濃度，OD260/OD280值應在1.7～1.9，檢測合格后于-20℃保存。

1.2.2 PCR擴增 取適量各樣品DNA，然后稀釋至1ng/μL，并以此為模板，使用帶Barcode的特異引物擴增rRNA和ITS rRNA的基因序列。16SV4區(qū)引物為515F-806R，ITS1區(qū)引物為ITS1F-ITS2，ITS2區(qū)引物為ITS2-3F-ITS2-4R。

PCR反應體系為 30μL：15μL Mix，2μL引物，10μL DNA，補ddH2O 至30μL。PCR 程序：98℃預變性1min；98℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72°C保持5min。

對PCR產(chǎn)物進行純化并使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，剪切回收目標條帶。

1.2.3 文庫構建與測序 使用賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構建，使用賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Ion S5TMXL進行上機測序。16S與ITS區(qū)域擴增子測序工作在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)處理：首先使用Cutadapt[9]對數(shù)據(jù)進行低質量部分剪切，再根據(jù)Barcode從得到的數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數(shù)據(jù)（raw reads），對上述數(shù)據(jù)進行去除嵌合體序列的處理，數(shù)據(jù)序列通過https://github.com/torognes/vsearch/[10]與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（clean reads）。

OTU聚類和物種注釋：使用Uparse軟件[11]對所有樣品的全部Clean read進行聚類，以＞97%的一致性（identity）系數(shù)將序列聚類成為OTU，同時選取OTU的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU的代表序列。再對OTU序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[12]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[13]進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0），獲得分類學信息，并分別在各分類水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成。使用MUSCLE軟件[14]（Version 3.8.31）進行多序列比對，再以各樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行均一化處理，用于后續(xù)樣本的多樣性分析（Alpha和Beta）。

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算香農(nóng)指數(shù)（Shannon），使用R軟件（Version 2.15.3）進行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析，分別進行有參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗。

2 結果與分析

2.1 種植蒼術前后土壤細菌及真菌的OTU變化

稀釋曲線用于檢測測序量是否充足，圖1顯示了樣品ZX3和ZXCK的3個重復樣品的細菌和真菌稀釋曲線。以抽取數(shù)據(jù)量序列數(shù)目為橫坐標，對應的細菌和真菌物種數(shù)OTU為縱坐標構建曲線。隨著測序數(shù)目的增加，曲線趨于平坦，說明增加更多的測序量只會出現(xiàn)少量的新物種（OTU）；隨著蒼術根際土壤樣本細菌和真菌序列數(shù)目的增多，稀釋曲線逐漸呈現(xiàn)平緩的趨勢，測序結果已基本覆蓋到樣品中所有的物種信息。

圖1 種植蒼術前后土壤細菌及真菌的稀釋曲線Fig.1 The dilution curves of bacteria and fungi in soil before and after planting A.lancea

韋恩圖可以直觀地體現(xiàn)2個樣本土壤細菌群落OTU組成的差異性及重疊情況，共有的OTU越多，說明二者的相似性越大。從圖2a可知，ZX3獨有的OTU數(shù)量為765個，ZXCK獨有的數(shù)量為950個，樣本ZX3和ZXCK共有的數(shù)目為2528個，共有的OTU占據(jù)總量的59.58%。從圖2b可知，ZX3獨有的OTU為1050個，ZXCK獨有的為912個，樣本ZX3和ZXCK共有的數(shù)目為1185個，共有的OTU占據(jù)總量的37.65%。從連作后樣本ZX3和ZXCK中細菌及真菌共有的OTU可知，連作后細菌和真菌的結構均發(fā)生了變化，且真菌的變化較細菌更大。

圖2 種植蒼術前后土壤細菌及真菌的韋恩圖Fig.2 The venn diagrams of bacteria and fungi before and after planting A.lancea

2.2 種植蒼術前后土壤細菌及真菌的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可反映微生物群落的豐度和多樣性。從表1可知，細菌多樣性中試驗組ZX3的Chao1指數(shù)為2103.02，Ace指數(shù)為2135.13，均比ZXCK低；ZX3的Shannon和辛普森指數(shù)均比ZXCK低。真菌多樣性指數(shù)顯示，ZX3組的Chao1和Ace指數(shù)比ZXCK組低，說明真菌群落豐富度ZX3組較低，連作后真菌的豐富度降低，而ZX3組的Shannon和辛普森指數(shù)比ZXCK組高，說明ZX3組真菌群落多樣性比ZXCK組高。連作后細菌群落多樣性和豐富度下降，真菌群落多樣性下降、豐富度上升，且細菌較真菌具有更高的穩(wěn)定性。

表1 細菌和真菌的Alpha多樣性指數(shù)表Table 1 The diversity index of bacteria and fungi

2.3 種植蒼術前后土壤細菌及真菌門水平的相對豐度分析

對細菌的物種豐度在門分類水平上進行了分析，圖3顯示了細菌物種相對豐度排名前10的物種，分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硬壁菌門（Firmicutes）、奇古菌門（Thaumarchaeota）和匿桿菌門（Latescibacteri）。其中變形菌門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為38.139%和38.715%；放線菌門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為18.020%和21.085%；酸桿菌門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為20.196%和22.334%；ZX3和ZXCK組相比，變形菌門和放線菌門的豐度下降，而酸桿菌門的相對豐度上升。

圖3 種植蒼術前后土壤細菌物種門分布Fig.3 Distribution of soil bacteria phyla before and after planting A.lancea

在門分類水平上對真菌的物種豐度進行分析，圖4顯示細菌物種相對豐度排名前10的物種，分別為子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、隱孢子菌（Aphelidiomycota）和新美鞭菌門（Neocallimastigomycota）。子囊菌門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為29.602%和41.530%；被孢霉門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為37.170%和21.669%；擔子菌門在ZX3和ZXCK組中的相對豐度分別為2.704%和18.893%；與ZXCK組相比，ZX3組中子囊菌門和擔子菌門的相對豐度下降，被孢霉門相對豐度上升。三者的相對豐度在ZX3和ZXCK組中差異較大。

圖4 種植蒼術前后土壤真菌物種門分布Fig.4 Distribution of soil fungal phyla before and after planting A.lancea

2.4 種植蒼術前后土壤細菌及真菌屬水平的差異物種分析

細菌物種差異分析（圖5）顯示，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）在2組樣品中物種差異最為顯著，在ZX3組中，其中慢生根瘤菌屬具有非常顯著的差異。節(jié)桿菌屬在2組樣品中有差異，但沒達顯著性。

圖5 種植蒼術前后土壤細菌物種差異分析Fig.5 Analysis of different species of soil bacteria before and after planting A.lancea

如圖6所示，Dactylonectria、曲霉屬（Aspergillus）、腐質霉屬（Humicola）和Striaticonidium在2組樣品中均具有顯著性差異，其中Dactylonectria和Striaticonidium具有極顯著差異。

圖6 種植蒼術前后土壤真菌差異物種分析Fig.6 Analysis of different species of soil fungi before and after planting A.lancea

選擇ZX3和ZXCK組中細菌豐度前10的細菌從屬水平上進行分析，如圖7所示，這10個屬的細菌總豐度占所有檢測到的屬水平的細菌物種的73.2%和76.2%，涵蓋了大部分的物種。由圖7可知，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、念珠菌屬（Solibacter）、羅丹桿菌屬（Rhodanobacter）、桿菌屬（Bryobacter）和Haliangium的豐富度在ZX3組中有下降趨勢，Burkholderiaceae、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、γ-變形菌（Gammaproteobacteria）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的豐度有所增加。其中鞘氨醇單胞菌屬在ZX3和ZXCK組所占的比例分別為4.6%和5.7%，Burkholderiaceae為6.3%和1.0%，羅丹桿菌屬為2.1%和3.0%，節(jié)桿菌屬為4.5%和1.7%。4個屬在2組樣本間的差異明顯。

圖7 種植蒼術前后土壤細菌優(yōu)勢屬分析Fig.7Analysis of dominant genes of soil bacteria before and after planting A.lancea

根據(jù)細菌優(yōu)勢屬聚類熱圖（圖8）可知，同一樣品中不同組的物種存在一定差異，但ZX3和ZXCK組間差異更為明顯，其中鏈霉菌屬的豐度在樣品ZX3中較高，而羅丹桿菌屬在樣品ZXCK中豐度較高。

圖8 種植蒼術前后土壤細菌優(yōu)勢屬的聚類熱圖Fig.8 Cluster heat map of the dominant genera of soil bacteria before and after planting A.lancea

選擇ZX3和ZXCK組中真菌豐度為前10的真菌從屬水平上進行分析（圖9），10個屬的真菌總豐度占所有檢測到的屬水平的真菌物種的67.1%和50.4%。由圖9可知，被孢霉屬（Mortierella）和假單胞菌屬（Pseudogymnoascus）在樣品ZXCK中的豐度有所降低，其中Scleroderma、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉菌屬（Penicillium）、綠僵菌屬（Metarhizium）、曲霉屬、毛囊菌屬（Trichocladium）和府球菌屬（Epicoccum）豐度增加。其中Scleroderma在ZX3和ZXCK組中所占的比例分別為0.001%和14.2%，被孢霉屬為14.2%和4.0%，青霉菌屬為1.9%和6.7%。3個屬的真菌在2組樣品間的差異較為顯著。由此推測，蒼術的連作與Scleroderma、被孢霉屬和青霉菌屬有著較為密切的關系。

圖9 種植蒼術前后土壤真菌優(yōu)勢屬分析Fig.9 Analysis of the dominant genera of soil fungi before and after planting A.lancea

根據(jù)真菌優(yōu)勢屬聚類熱圖（圖10）可知，假裸囊菌屬和被孢霉屬在樣品ZX3中豐度較高，府球菌屬和Scleroderma在ZXCK中豐度更高。

圖10 種植蒼術前后土壤真菌優(yōu)勢屬的聚類熱圖Fig.10 Cluster heat map of the dominant genus of soil fungi before and after planting A.lancea

3 討論

研究[15]表明，長期單一栽培方式會降低作物產(chǎn)量并對品質產(chǎn)生不利影響。大多數(shù)以根莖入藥的植物都存在此問題，如三七、人參和白術[16]。土壤微生物結構的改變、作物病害蟲的加重和藥用植物的自毒現(xiàn)象都是作物長期連續(xù)栽種中容易出現(xiàn)的問題[17-18]。其中，土壤微生物結構的改變對作物生長產(chǎn)生較大的影響。土壤微生物可調節(jié)土壤環(huán)境，疾病的發(fā)生通常與微生物異常有關，土壤中的病害菌可導致作物病害的發(fā)生，有益菌可增強作物的抗逆性和整體適應性[19]，微生物多樣性被認為是預防疾病的關鍵因素[20]。不同類型的土壤和植被可產(chǎn)生不同的生物區(qū)系，這與土壤微生物相互作用的復雜性有關，包括微生物與土壤和植物的相互作用[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，蒼術栽培3年后呈現(xiàn)出細菌群落多樣性和豐富度降低而真菌群落豐富度降低、多樣性升高的現(xiàn)象。郭蘭萍等[22]對種植蒼術的土壤微生物研究結果顯示，栽培2年的蒼術根際土壤細菌和真菌的微生物群落結構均低于1年生樣品，與本研究結果相似，即栽培蒼術前后根際土壤的微生物結構發(fā)生改變。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，栽培蒼術后根際土壤微生物呈有益菌下降、有害菌增長的趨勢，部分重要微生物的結構失衡。其中有益菌變形菌門、放線菌門、子囊菌門、擔子菌門和羅丹桿菌屬等的豐度下降。研究[22]表明，變形菌和放線菌與疾病抑制有關，放線菌能夠促進植株的生長和病害的防治，是植株根際重要的有益菌。子囊菌門和擔子菌門是土壤中重要的分解者，大多數(shù)的子囊菌門為腐生菌，可以分解很多難降解的有機質，在養(yǎng)分的循環(huán)中起著重要作用[23]。連作后子囊菌門和擔子菌門豐度下降，根際土壤養(yǎng)分循環(huán)受影響，可能會導致蒼術藥材品質下降。羅丹桿菌屬有助于作物的生長，其可拮抗根腐菌，對作物來說是有益菌。有害菌被孢霉門、青霉菌屬和Dactylonectria相對豐度上升，多數(shù)被孢霉門可在土壤中進行腐生，少數(shù)是樹木的菌根菌，在發(fā)病的土壤中被孢霉門的豐度通常會偏高，在大豆的連作障礙研究中發(fā)現(xiàn)，青霉菌屬中的紫青霉菌分泌的毒素會抑制大豆的生長[24]，青霉菌屬的部分物種還可導致果實的腐爛，部分菌屬與生物碳復合，降低土壤中有效砷的含量，改變土壤中的微生物環(huán)境[25-26]。Dactylonectria真菌大多與植物病害發(fā)生有關[27-30]。慢生根瘤菌屬、關節(jié)細菌屬、酸桿菌門、鞘氨醇單胞菌屬、伯克式菌屬（Burkholderiaceae）、節(jié)桿菌屬、硬皮馬勃屬（Scleroderma）和被孢霉屬等菌群連作前后發(fā)生變化。酸桿菌門的平衡與作物的生長也有著密切的關系[31]。慢生根瘤菌屬是變形菌門α變形菌綱的一種根瘤菌[32]，可變換大氣中游離氮形式，從而利于寄主生物充分利用，例如氨（NH3）或銨（NH4+）[33]，兩者均與植株的生長有關聯(lián)。鞘氨醇單胞菌屬可降解纖維素，其通過吸收利用葡萄糖可解除葡萄糖對纖維素酶的抑制作用[34]。栽種蒼術后，以上菌群發(fā)生改變。

有研究[35]顯示，隨栽培年限的增加，植株根際分泌物增加，此往往會促進某一類或幾類微生物數(shù)量的增加或減少，影響微生物結構，同時土壤本身的理化性質以及作物的田間管理也會影響到土壤微生物的結構以及作物的生長狀況。研究[36-38]表明，選用高抗品種，實行合理的輪作間作、施用有機肥和菌肥，對土壤進行定期的消毒，連作后進行深耕等可以緩解連作帶來的不良影響。因此，建議在種植蒼術時可與玉米和花生等作物進行間作或輪種，施用石灰和有機肥對土壤進行處理等，綜合利用多種措施改善蒼術的種植條件，減少病蟲害的發(fā)生，提高人工栽培的蒼術品質。

4 結論

栽培3年后的蒼術根際土壤與未種植過蒼術的根際土壤相比，土壤細菌和真菌結構發(fā)生變化，細菌群落多樣性和豐富度下降，真菌群落多樣性下降、豐富度上升。其中有益菌相對豐度下降，有害菌相對豐度增加，一些重要菌群失衡。說明蒼術的多年栽培引起了根際土壤菌群的改變，這些改變可能使得土壤的養(yǎng)分循環(huán)和理化性質等受到影響，進而引起蒼術病害的發(fā)生，造成藥材品質的下降。因此維持蒼術根際土壤微生物菌群的平衡是防治蒼術病害發(fā)生和提高藥材品質的有效途徑之一。