• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-21對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

    2022-11-18 13:47:36張兵王孝玉朱亞輝張仕慧胡凌云
    西部醫(yī)學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:滑膜孵育通路

    張兵 王孝玉 朱亞輝 張仕慧 胡凌云

    (南充市中心醫(yī)院 1.骨科;2.醫(yī)學(xué)影像科,四川 南充 637000)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rrheumatoidarthritis, RA)屬于全身性免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征,目前其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1-2]。正常的滑膜組織是由結(jié)締組織以及滑膜襯里層組成,襯里層包括滑膜成纖維細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS),對(duì)維持關(guān)節(jié)腔具有穩(wěn)定的作用,參與RA病理變化[3-4]。研究顯示,RA與基因表達(dá)有關(guān),基因調(diào)控FLS細(xì)胞的增殖和凋亡,分子靶向治療可能是RA潛在的治療方式[5]。miRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的能力,其長(zhǎng)度一般在20 nt左右,miRNA與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等有關(guān)[6-8]。miRNA還與人類疾病如腫瘤、糖尿病等疾病的進(jìn)展有關(guān),對(duì)分子靶向治療的具有重要作用[9-10]。研究顯示miR-21具有調(diào)控胚胎發(fā)育、器官形成、腫瘤、哮喘、成骨分化等的進(jìn)展有關(guān)[11-13]。有研究顯示,上調(diào)miR-21表達(dá)減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎指數(shù),改善RA癥狀[14]。RA患者中miR-21表達(dá)量降低,抑制miR-21能夠促進(jìn)RA-FLS釋放炎癥因子,以及改善RA患者Th17/Treg細(xì)胞失衡[15-16]。這些研究均證明了miR-21參與RA進(jìn)展。目前尚不明確miR-21在RA-FLS增殖和凋亡中的作用。本次實(shí)驗(yàn)體外分離培養(yǎng)RA-FLS,探討miR-21對(duì)RA-FLS增殖、凋亡的影響和可能機(jī)制,為基因靶向治療RA提供可能思路。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑 RA患者以及健康對(duì)照(關(guān)節(jié)外傷)滑膜組織均采集自2018年7月~2020年2月南充市中心醫(yī)院;蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)抗體購自美國Invitrogen公司;miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit購自丹麥Exiqon公司;B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體購自上海晅科生物科技有限公司;p-PI3K抗體購自上海鑫樂生物科技有限公司;RNAiso for Small RNA購自寶生物工程(大連)有限公司;Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體、p-Akt抗體購自美國santacruze公司;mimics control、miR-21 mimics由Thermo Fisher Scientific公司構(gòu)建;C-Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;磷脂酰肌醇-3激酶(Phospoinositide 3-kinase,PI3K)抗體購自美國Abcam公司。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

    1.2 方法

    1.2.1 FLS分離培養(yǎng)[13]RA滑膜組織和健康滑膜組織均浸泡在含有10%雙抗的PBS溶液內(nèi),將表面的脂肪等組織去除,再次用PBS洗滌2次。用剪刀和鑷子把組織剪碎,大小約為1 mm3,置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),添加適量的0.4%的Ⅰ型膠原酶消化,期間每間隔30 min將細(xì)胞瓶翻轉(zhuǎn),2 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出,以吸管將細(xì)胞沉淀混勻,1000 g離心10 min。添加含有EDTA-0.25%胰蛋白酶的消化液孵育30 min,期間每隔10 min搖晃1次。添加DMEM,過濾(200目),1000 g離心10 min,棄掉上清溶液,添加培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM)懸浮,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。48 h后,更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,將懸浮的細(xì)胞棄掉,繼續(xù)培養(yǎng),期間每隔2 d換液1次,培養(yǎng)至第3代,經(jīng)細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定為FLS(Vimentin表達(dá)陽性,CD68表達(dá)陰性)。

    1.2.2 Realtime PCR方法檢測(cè)miR-21表達(dá) 取第4代RA-FLS和正常-FLS,添加RNAiso for Small RNA試劑,常規(guī)方法提取miRNA,將miRNA溶解在DEPC水中,放在-80℃保存。利用miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),取0.5 μg的miRNA樣品,添加5 μL的mRQ Buffer、1.25 μL的mRQ Enzyme,充分混合后,放在37℃孵育1 h,然后放在85℃孵育5 min,合成的cDNA放在-20℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)如下:2 μL的cDNA、0.5 μL的mRQ 3'primer、0.5 μL的miRNA-specific primer、0.5 μL的ROX Dye、12.5 μL的SYBR advantage premix,最后添加ddH2O至25 μL,設(shè)置反應(yīng)條件如下:95℃ 10 s,95℃ 5 s,60℃ 20 s,72℃ 30 s。U6作為內(nèi)參,按照2-△△Ct法計(jì)算miR-21的表達(dá)變化。

    1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 RA-FLS接種到6孔板內(nèi),分別把mimics control、miR-21 mimics轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染mimics control、miR-21 mimics以后的RA-FLS設(shè)置為miR-NC組、miR-21組,Control組為沒有轉(zhuǎn)染的RA-FLS。Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,按照1.2.2中方法檢測(cè)miR-21的表達(dá)差異。

    1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性變化 RA-FLS配制成5×104個(gè)細(xì)胞/mL,分別吸取100 μL的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板內(nèi),在37℃過夜,按照Control組、miR-NC組、miR-21組方法分組處理,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分別在細(xì)胞中添加10 μL 的CCK-8溶液,繼續(xù)放在37℃孵育1 h,檢測(cè)450 nm的A值。A值表示細(xì)胞增殖活性大小。

    1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,分別用PBS將細(xì)胞洗滌3次,最后將細(xì)胞懸浮在400 μL的結(jié)合緩沖液中,添加5 μL的Annexin V-FITC溶液,放在室溫孵育20 min,繼續(xù)添加5 μL的PI溶液,放在室溫孵育20 min,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

    1.2.6 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分別在細(xì)胞中添加細(xì)胞裂解溶液(PMSF∶RIPA=1∶100),放在冰上孵育30 min,以細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集,轉(zhuǎn)移到干凈的EP管內(nèi),4℃,12000 g離心10 min,上清吸取到新的EP管內(nèi),放在-80℃保存。利用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品和等體積的Loading Buffer混合后,在100℃煮沸5 min。把蛋白添加到上樣孔內(nèi),每個(gè)孔中加40 μg的蛋白。首先按照60 V的電壓電泳,等到染料電泳至濃縮膠和分離膠的分層處時(shí),更換成90 V的電壓繼續(xù)電泳,觀察染料到達(dá)底部邊緣之后,停止電泳。NC膜根據(jù)凝膠的大小裁剪,然后浸泡在甲醇中濕潤(rùn)15 s,浸泡至轉(zhuǎn)膜緩沖液中孵育5 min。以常規(guī)方法在4℃進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜電流為300 mA,轉(zhuǎn)膜2 h后,取出NC膜。將NC膜浸泡在5%牛血清白蛋白中,在室溫中孵育1 h。然后將NC膜放在一抗溶液中(C-Caspase-3抗體按照1∶800稀釋,Akt、PI3K、Bax、Bcl-2抗體按照1∶1000稀釋,p-PI3K、p-Akt抗體按照1∶600稀釋),在4℃結(jié)合過夜。NC膜放在二抗溶液中,在室溫中結(jié)合2 h。以ECL方法顯色。分析條帶的灰度值,根據(jù)灰度值,以GAPDH作為參照,分析蛋白水平。

    1.2.7 PI3K/Akt信號(hào)激活劑對(duì)miR-21影響FLS細(xì)胞增殖和凋亡的作用測(cè)定 取轉(zhuǎn)染了miR-21 mimics后的RA-FLS,以含有100 ng/mL的PI3K/Akt信號(hào)通路特異性激活劑胰島素生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)處理,記為miR-21+IGF-1組,以miR-21組為參照,檢測(cè)細(xì)胞增殖(步驟參照1.2.4中CCK-8)、凋亡(步驟參照1.2.5中流式細(xì)胞術(shù))和細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)(步驟參照1.2.6中Western blot)。

    2 結(jié)果

    2.1 RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低 與正常-FLS比較,RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低(P<0.05)。提示RA-FLS中miR-21低表達(dá)。見表1。

    表1 正常-FLS和RA-FLS中miR-21的表達(dá)水平比較

    2.2 miR-21對(duì)RA-FLS增殖和凋亡影響 與Control組、miR-NC組比較,miR-21組RA-FLS細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平升高,細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS增殖活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖1、表2。

    圖1 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)變化

    2.3 miR-21對(duì)RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)通路的作用 與Control組、miR-NC組比較,miR-21組RA-FLS細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平均降低(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)通路激活水平。見圖2、表3。

    表2 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平比較

    圖2 上調(diào)miR-21對(duì)RA-FLS細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)影響

    2.4 PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑對(duì)miR-21影響RA-FLS增殖、凋亡的作用 與miR-21組比較,miR-21+

    表3 上調(diào)miR-21后RA-FLS細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平比較

    IGF-1組RA-FLS增殖活性升高,細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)增多,C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)減少,Bcl-2蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。提示激活PI3K/Akt信號(hào)逆轉(zhuǎn)miR-21對(duì)RA-FLS增殖、凋亡作用。見圖3、表4。

    圖3 IGF-1對(duì)上調(diào)miR-21的RA-FLS細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)影響

    表4 表4 IGF-1上調(diào)miR-21后RA-FLS細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平比較

    3 討論

    RA發(fā)病率較高,患者的關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生炎癥后,能誘導(dǎo)軟骨、骨組織損傷,最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)功能障礙,影響RA患者正常行動(dòng)能力和勞動(dòng)能力[17-19]。滑膜組織增生是RA發(fā)生的典型特征,雖然炎癥在滑膜襯里層中長(zhǎng)期存在,但RA-FLS過度增殖是誘導(dǎo)滑膜增生的關(guān)鍵因素[20-21]。既往研究顯示,miRNA參與RA發(fā)生,能夠影響RA-FLS生物學(xué)行為[22]。Liu等[14]研究顯示,miR-21與RA有關(guān),過表達(dá)miR-21減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥。Hu等[15]研究結(jié)果顯示,miR-21對(duì)RA-FLS釋放炎癥因子的有抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低,上調(diào)miR-21可降低RA-FLS細(xì)胞增殖活性,提示上調(diào)miR-21抑制RA-FLS增殖,這與以上的研究結(jié)果相符合,表明miR-21在RA進(jìn)展中可能扮演抑制因子的作用。

    RA患者中FLS過度增殖的同時(shí)細(xì)胞凋亡減少。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜過程,與細(xì)胞凋亡有關(guān)調(diào)控因子很多,Caspase-3是Caspase蛋白家族中的凋亡執(zhí)行因子,Caspase-3活化后形成C-Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[23]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,Bax屬于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白,Bcl-2屬于Bcl-2蛋白家族中的抑凋亡蛋白,二者表達(dá)改變與細(xì)胞凋亡進(jìn)程有關(guān)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-21后的RA-FLS中C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均升高,而Bcl-2蛋白水平降低,上調(diào)miR-21誘導(dǎo)RA-FLS凋亡,這與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相一致,miR-21具有誘導(dǎo)RA-FLS凋亡的作用。

    信號(hào)通路在RA發(fā)生中作用廣泛,PI3K/Akt是在RA中過度激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平抑制RA-FLS細(xì)胞增殖[26]。miRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的作用,其可以通過調(diào)控下游信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用,并且在不同的病理或生理過程中miRNA的調(diào)控機(jī)制有差異[27]。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-21后的RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)激活水平降低,且PI3K/Akt信號(hào)激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-21抗RA-FLS增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,這進(jìn)一步說明了miR-21通過PI3K/Akt信號(hào)發(fā)揮作用。

    miR-21在RA-FLS中可能發(fā)揮保護(hù)作用,miR-21通過降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平抑制RA-FLS增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為分子靶向治療RA提供了參考思路。本研究不足之處在于,miR-21通過PI3K/Akt信號(hào)對(duì)RA具體作用機(jī)制還不明確,需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

    4 結(jié)論

    上調(diào)miR-21可抑制RA-FLS增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能與降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平有關(guān)。

    猜你喜歡
    滑膜孵育通路
    基于滑膜控制的船舶永磁同步推進(jìn)電機(jī)直接轉(zhuǎn)矩控制研究
    高層建筑施工中的滑膜施工技術(shù)要點(diǎn)探討
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測(cè)定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    滑膜肉瘤的研究進(jìn)展
    Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路促使性早熟形成的作用觀察
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對(duì)重模式應(yīng)有再認(rèn)識(shí)
    原發(fā)性肺滑膜肉瘤診斷與治療——附一例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久久久精品古装| 高清在线视频一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 3wmmmm亚洲av在线观看| av在线播放精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产成人freesex在线| 国产永久视频网站| 国产男女内射视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品一区二区三卡| 男的添女的下面高潮视频| 少妇丰满av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲精品一区蜜桃| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最黄视频免费看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男女免费视频国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 六月丁香七月| 一级黄片播放器| 黄色欧美视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 激情 狠狠 欧美| 精品人妻熟女av久视频| 日本欧美视频一区| av网站免费在线观看视频| 日韩大片免费观看网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品亚洲成a人片在线观看 | 国产成人a∨麻豆精品| 晚上一个人看的免费电影| 国产伦在线观看视频一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 夫妻午夜视频| 99热这里只有是精品在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 91久久精品国产一区二区三区| a 毛片基地| 精品一区二区三卡| 午夜福利在线在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 妹子高潮喷水视频| 一个人看视频在线观看www免费| 只有这里有精品99| 亚洲色图综合在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 岛国毛片在线播放| 99热国产这里只有精品6| 嫩草影院新地址| 超碰97精品在线观看| 麻豆成人av视频| 亚洲精品视频女| 精品久久国产蜜桃| 2021少妇久久久久久久久久久| 又爽又黄a免费视频| 欧美区成人在线视频| 少妇人妻久久综合中文| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩视频在线欧美| 日日啪夜夜撸| 天美传媒精品一区二区| 久久精品国产a三级三级三级| 人妻制服诱惑在线中文字幕| www.色视频.com| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 老女人水多毛片| 三级经典国产精品| 国产亚洲91精品色在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人一区二区在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品伦人一区二区| 免费av不卡在线播放| 黄片wwwwww| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费在线观看成人毛片| 97超碰精品成人国产| 男女边摸边吃奶| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲四区av| 在线观看人妻少妇| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品国产成人久久av| 丝袜脚勾引网站| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av二区三区四区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中国三级夫妇交换| 日韩制服骚丝袜av| 99久国产av精品国产电影| 免费黄网站久久成人精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲国产av新网站| 国产免费视频播放在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 免费大片18禁| 简卡轻食公司| 国产 一区 欧美 日韩| 免费看不卡的av| 国产免费一级a男人的天堂| 一级片'在线观看视频| 热99国产精品久久久久久7| 免费黄网站久久成人精品| 国产欧美亚洲国产| freevideosex欧美| 国产精品三级大全| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲精品456在线播放app| 少妇的逼水好多| 三级国产精品欧美在线观看| 最黄视频免费看| 视频中文字幕在线观看| 国产 精品1| 亚洲不卡免费看| 国产毛片在线视频| 成人免费观看视频高清| 成人亚洲精品一区在线观看 | 视频区图区小说| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲色图综合在线观看| 日本一二三区视频观看| 美女高潮的动态| 黑人猛操日本美女一级片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费观看的影片在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黄色日韩在线| 只有这里有精品99| 丰满乱子伦码专区| 大香蕉97超碰在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久这里有精品视频免费| 免费高清在线观看视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 黄色欧美视频在线观看| 欧美bdsm另类| 亚洲国产色片| 看免费成人av毛片| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品第二区| 欧美人与善性xxx| 精品国产三级普通话版| 熟女人妻精品中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产男女超爽视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品久久久久久久电影| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91aial.com中文字幕在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 青青草视频在线视频观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲久久久国产精品| 日韩制服骚丝袜av| 干丝袜人妻中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 大码成人一级视频| 一级av片app| 精品国产露脸久久av麻豆| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| av一本久久久久| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久久九九精品二区国产| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 精品国产乱码久久久久久小说| 在现免费观看毛片| 色综合色国产| 伦理电影免费视频| 在线观看一区二区三区激情| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人无遮挡网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲综合精品二区| 欧美+日韩+精品| 日韩三级伦理在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久热精品热| 婷婷色综合www| 91狼人影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日本黄色片子视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品人妻久久久影院| 婷婷色av中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 大码成人一级视频| 伊人久久国产一区二区| 美女主播在线视频| 色视频www国产| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 黑丝袜美女国产一区| 麻豆国产97在线/欧美| 九九爱精品视频在线观看| 日韩欧美 国产精品| 嫩草影院新地址| 在线观看免费视频网站a站| 精品国产三级普通话版| 免费看日本二区| 成人毛片60女人毛片免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 在线观看一区二区三区| 国产美女午夜福利| 99精国产麻豆久久婷婷| 麻豆国产97在线/欧美| 超碰97精品在线观看| 大陆偷拍与自拍| www.色视频.com| 99久国产av精品国产电影| 日韩电影二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费av中文字幕在线| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产精品久久久久久久久免| 国产深夜福利视频在线观看| 两个人的视频大全免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 街头女战士在线观看网站| 久久99热这里只频精品6学生| 内地一区二区视频在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 老女人水多毛片| 身体一侧抽搐| 少妇被粗大猛烈的视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久网色| 久久久a久久爽久久v久久| 男女边摸边吃奶| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品一区蜜桃| 寂寞人妻少妇视频99o| 97超视频在线观看视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美成人精品一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日日撸夜夜添| 国产免费一区二区三区四区乱码| 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美精品自产自拍| 九色成人免费人妻av| 热re99久久精品国产66热6| 不卡视频在线观看欧美| 国产黄色免费在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产亚洲一区二区精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 少妇的逼好多水| 精品人妻熟女av久视频| 99国产精品免费福利视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品久久久久成人av| 涩涩av久久男人的天堂| 永久免费av网站大全| 亚洲精品国产色婷婷电影| 香蕉精品网在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品日本国产第一区| 在线观看一区二区三区激情| 免费观看av网站的网址| 国产精品免费大片| 美女cb高潮喷水在线观看| av专区在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 色哟哟·www| 一级黄片播放器| 国产毛片在线视频| av免费观看日本| 亚洲高清免费不卡视频| 伊人久久国产一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国国产精品蜜臀av免费| 久久人人爽人人片av| 岛国毛片在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 性色avwww在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久99蜜桃精品久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av专区在线播放| 日韩欧美 国产精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 91精品国产九色| 亚洲经典国产精华液单| 久久久国产一区二区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲内射少妇av| 国产精品久久久久久精品古装| 人体艺术视频欧美日本| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩成人伦理影院| 在线观看一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品,欧美精品| 欧美zozozo另类| 涩涩av久久男人的天堂| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产91av在线免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 青春草国产在线视频| .国产精品久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 好男人视频免费观看在线| 秋霞伦理黄片| 亚洲av福利一区| 久久久a久久爽久久v久久| 美女国产视频在线观看| 老熟女久久久| 我的女老师完整版在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 99热国产这里只有精品6| 国产精品蜜桃在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 极品教师在线视频| 视频区图区小说| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 成年免费大片在线观看| 国产一区二区三区av在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 我的老师免费观看完整版| 一二三四中文在线观看免费高清| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 精品一区二区三区视频在线| 欧美xxⅹ黑人| 乱系列少妇在线播放| 免费观看在线日韩| 日本一二三区视频观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最近的中文字幕免费完整| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品夜色国产| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩一区二区三区影片| 成人黄色视频免费在线看| 久热久热在线精品观看| 久久精品国产自在天天线| 晚上一个人看的免费电影| 国产一区二区在线观看日韩| 嘟嘟电影网在线观看| 国产 一区精品| 免费看av在线观看网站| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲图色成人| 亚洲精品色激情综合| 亚洲人成网站高清观看| 国产成人精品婷婷| 欧美97在线视频| 精品久久久久久久久av| 日韩一区二区视频免费看| 国产男女内射视频| 久久亚洲国产成人精品v| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲国产精品999| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日本视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲国产最新在线播放| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99热全是精品| 婷婷色综合大香蕉| 老熟女久久久| 欧美精品国产亚洲| 18+在线观看网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 99久国产av精品国产电影| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲人与动物交配视频| 国产 一区精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 美女国产视频在线观看| 国产淫语在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品久久久久久av不卡| 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区乱码不卡18| 制服丝袜香蕉在线| 久久精品国产亚洲网站| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 七月丁香在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看 | 超碰97精品在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲第一av免费看| 欧美另类一区| 亚洲久久久国产精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 成人亚洲欧美一区二区av| 一本一本综合久久| 午夜福利高清视频| 久久精品国产亚洲网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级爰片在线观看| 男女国产视频网站| 色5月婷婷丁香| 久久青草综合色| 少妇熟女欧美另类| av在线观看视频网站免费| 一级av片app| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品一区二区在线不卡| 免费看光身美女| 男男h啪啪无遮挡| 全区人妻精品视频| 水蜜桃什么品种好| 日韩中字成人| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美精品国产亚洲| 熟女av电影| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲av.av天堂| videos熟女内射| 国产亚洲91精品色在线| 高清视频免费观看一区二区| 免费观看无遮挡的男女| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日韩精品成人综合77777| 内地一区二区视频在线| 最新中文字幕久久久久| 如何舔出高潮| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 女性被躁到高潮视频| 欧美区成人在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99re6热这里在线精品视频| 激情五月婷婷亚洲| 欧美97在线视频| 777米奇影视久久| 伊人久久国产一区二区| 一区二区av电影网| 久久久久久人妻| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费看日本二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 久久99蜜桃精品久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 1000部很黄的大片| 老司机影院成人| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久久久九九精品二区国产| 精品一区二区三区视频在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 又大又黄又爽视频免费| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本wwww免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 99热这里只有精品一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产久久久一区二区三区| 一本色道久久久久久精品综合| 在线观看免费视频网站a站| 中国国产av一级| 大香蕉久久网| 久久97久久精品| 五月开心婷婷网| 91久久精品国产一区二区成人| 观看免费一级毛片| 中文欧美无线码| 少妇人妻精品综合一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 欧美一级a爱片免费观看看| 大片电影免费在线观看免费| 免费黄频网站在线观看国产| 我的女老师完整版在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 大码成人一级视频| 亚洲三级黄色毛片| 多毛熟女@视频| 伦精品一区二区三区| 嫩草影院新地址| 伦理电影大哥的女人| 一区二区三区免费毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 在线 av 中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲真实伦在线观看| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲综合色惰| 精品久久久噜噜| 久久久久视频综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看不卡的av| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲欧美日韩东京热| 国模一区二区三区四区视频| 永久网站在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男人舔奶头视频| 嘟嘟电影网在线观看| 成人国产麻豆网| 日韩电影二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费看日本二区| 日韩av免费高清视频| 黄色一级大片看看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 99热国产这里只有精品6| 欧美变态另类bdsm刘玥| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 少妇精品久久久久久久| 视频中文字幕在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 直男gayav资源| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 在线天堂最新版资源| 妹子高潮喷水视频| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清日韩中文字幕在线| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人aa在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费观看的影片在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品国产av成人精品| av国产免费在线观看| av专区在线播放| 性色avwww在线观看| 一区在线观看完整版| 人妻 亚洲 视频| 欧美成人a在线观看| 久久久午夜欧美精品| 老女人水多毛片| 黄色怎么调成土黄色| 日韩一本色道免费dvd| 精品亚洲成国产av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 1000部很黄的大片| 日日啪夜夜爽| 免费观看性生交大片5| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产在线一区二区三区精| 午夜免费鲁丝| 国产精品一区二区性色av| av线在线观看网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久人妻| 免费大片18禁| 中文天堂在线官网| 国产亚洲av片在线观看秒播厂|