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    miR-21對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

    2022-11-18 13:47:36張兵王孝玉朱亞輝張仕慧胡凌云
    西部醫(yī)學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:滑膜孵育通路

    張兵 王孝玉 朱亞輝 張仕慧 胡凌云

    (南充市中心醫(yī)院 1.骨科;2.醫(yī)學(xué)影像科,四川 南充 637000)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rrheumatoidarthritis, RA)屬于全身性免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征,目前其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1-2]。正常的滑膜組織是由結(jié)締組織以及滑膜襯里層組成,襯里層包括滑膜成纖維細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS),對(duì)維持關(guān)節(jié)腔具有穩(wěn)定的作用,參與RA病理變化[3-4]。研究顯示,RA與基因表達(dá)有關(guān),基因調(diào)控FLS細(xì)胞的增殖和凋亡,分子靶向治療可能是RA潛在的治療方式[5]。miRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的能力,其長(zhǎng)度一般在20 nt左右,miRNA與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等有關(guān)[6-8]。miRNA還與人類疾病如腫瘤、糖尿病等疾病的進(jìn)展有關(guān),對(duì)分子靶向治療的具有重要作用[9-10]。研究顯示miR-21具有調(diào)控胚胎發(fā)育、器官形成、腫瘤、哮喘、成骨分化等的進(jìn)展有關(guān)[11-13]。有研究顯示,上調(diào)miR-21表達(dá)減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎指數(shù),改善RA癥狀[14]。RA患者中miR-21表達(dá)量降低,抑制miR-21能夠促進(jìn)RA-FLS釋放炎癥因子,以及改善RA患者Th17/Treg細(xì)胞失衡[15-16]。這些研究均證明了miR-21參與RA進(jìn)展。目前尚不明確miR-21在RA-FLS增殖和凋亡中的作用。本次實(shí)驗(yàn)體外分離培養(yǎng)RA-FLS,探討miR-21對(duì)RA-FLS增殖、凋亡的影響和可能機(jī)制,為基因靶向治療RA提供可能思路。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑 RA患者以及健康對(duì)照(關(guān)節(jié)外傷)滑膜組織均采集自2018年7月~2020年2月南充市中心醫(yī)院;蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)抗體購自美國Invitrogen公司;miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit購自丹麥Exiqon公司;B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體購自上海晅科生物科技有限公司;p-PI3K抗體購自上海鑫樂生物科技有限公司;RNAiso for Small RNA購自寶生物工程(大連)有限公司;Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)抗體、p-Akt抗體購自美國santacruze公司;mimics control、miR-21 mimics由Thermo Fisher Scientific公司構(gòu)建;C-Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;磷脂酰肌醇-3激酶(Phospoinositide 3-kinase,PI3K)抗體購自美國Abcam公司。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

    1.2 方法

    1.2.1 FLS分離培養(yǎng)[13]RA滑膜組織和健康滑膜組織均浸泡在含有10%雙抗的PBS溶液內(nèi),將表面的脂肪等組織去除,再次用PBS洗滌2次。用剪刀和鑷子把組織剪碎,大小約為1 mm3,置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),添加適量的0.4%的Ⅰ型膠原酶消化,期間每間隔30 min將細(xì)胞瓶翻轉(zhuǎn),2 h后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出,以吸管將細(xì)胞沉淀混勻,1000 g離心10 min。添加含有EDTA-0.25%胰蛋白酶的消化液孵育30 min,期間每隔10 min搖晃1次。添加DMEM,過濾(200目),1000 g離心10 min,棄掉上清溶液,添加培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM)懸浮,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。48 h后,更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,將懸浮的細(xì)胞棄掉,繼續(xù)培養(yǎng),期間每隔2 d換液1次,培養(yǎng)至第3代,經(jīng)細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定為FLS(Vimentin表達(dá)陽性,CD68表達(dá)陰性)。

    1.2.2 Realtime PCR方法檢測(cè)miR-21表達(dá) 取第4代RA-FLS和正常-FLS,添加RNAiso for Small RNA試劑,常規(guī)方法提取miRNA,將miRNA溶解在DEPC水中,放在-80℃保存。利用miR-X miRNA First-Strand Synthesis kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),取0.5 μg的miRNA樣品,添加5 μL的mRQ Buffer、1.25 μL的mRQ Enzyme,充分混合后,放在37℃孵育1 h,然后放在85℃孵育5 min,合成的cDNA放在-20℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)如下:2 μL的cDNA、0.5 μL的mRQ 3'primer、0.5 μL的miRNA-specific primer、0.5 μL的ROX Dye、12.5 μL的SYBR advantage premix,最后添加ddH2O至25 μL,設(shè)置反應(yīng)條件如下:95℃ 10 s,95℃ 5 s,60℃ 20 s,72℃ 30 s。U6作為內(nèi)參,按照2-△△Ct法計(jì)算miR-21的表達(dá)變化。

    1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 RA-FLS接種到6孔板內(nèi),分別把mimics control、miR-21 mimics轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染mimics control、miR-21 mimics以后的RA-FLS設(shè)置為miR-NC組、miR-21組,Control組為沒有轉(zhuǎn)染的RA-FLS。Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后,按照1.2.2中方法檢測(cè)miR-21的表達(dá)差異。

    1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性變化 RA-FLS配制成5×104個(gè)細(xì)胞/mL,分別吸取100 μL的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板內(nèi),在37℃過夜,按照Control組、miR-NC組、miR-21組方法分組處理,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分別在細(xì)胞中添加10 μL 的CCK-8溶液,繼續(xù)放在37℃孵育1 h,檢測(cè)450 nm的A值。A值表示細(xì)胞增殖活性大小。

    1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,分別用PBS將細(xì)胞洗滌3次,最后將細(xì)胞懸浮在400 μL的結(jié)合緩沖液中,添加5 μL的Annexin V-FITC溶液,放在室溫孵育20 min,繼續(xù)添加5 μL的PI溶液,放在室溫孵育20 min,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

    1.2.6 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)變化 Control組、miR-NC組、miR-21組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分別在細(xì)胞中添加細(xì)胞裂解溶液(PMSF∶RIPA=1∶100),放在冰上孵育30 min,以細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集,轉(zhuǎn)移到干凈的EP管內(nèi),4℃,12000 g離心10 min,上清吸取到新的EP管內(nèi),放在-80℃保存。利用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品和等體積的Loading Buffer混合后,在100℃煮沸5 min。把蛋白添加到上樣孔內(nèi),每個(gè)孔中加40 μg的蛋白。首先按照60 V的電壓電泳,等到染料電泳至濃縮膠和分離膠的分層處時(shí),更換成90 V的電壓繼續(xù)電泳,觀察染料到達(dá)底部邊緣之后,停止電泳。NC膜根據(jù)凝膠的大小裁剪,然后浸泡在甲醇中濕潤(rùn)15 s,浸泡至轉(zhuǎn)膜緩沖液中孵育5 min。以常規(guī)方法在4℃進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜電流為300 mA,轉(zhuǎn)膜2 h后,取出NC膜。將NC膜浸泡在5%牛血清白蛋白中,在室溫中孵育1 h。然后將NC膜放在一抗溶液中(C-Caspase-3抗體按照1∶800稀釋,Akt、PI3K、Bax、Bcl-2抗體按照1∶1000稀釋,p-PI3K、p-Akt抗體按照1∶600稀釋),在4℃結(jié)合過夜。NC膜放在二抗溶液中,在室溫中結(jié)合2 h。以ECL方法顯色。分析條帶的灰度值,根據(jù)灰度值,以GAPDH作為參照,分析蛋白水平。

    1.2.7 PI3K/Akt信號(hào)激活劑對(duì)miR-21影響FLS細(xì)胞增殖和凋亡的作用測(cè)定 取轉(zhuǎn)染了miR-21 mimics后的RA-FLS,以含有100 ng/mL的PI3K/Akt信號(hào)通路特異性激活劑胰島素生長(zhǎng)因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)處理,記為miR-21+IGF-1組,以miR-21組為參照,檢測(cè)細(xì)胞增殖(步驟參照1.2.4中CCK-8)、凋亡(步驟參照1.2.5中流式細(xì)胞術(shù))和細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)(步驟參照1.2.6中Western blot)。

    2 結(jié)果

    2.1 RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低 與正常-FLS比較,RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低(P<0.05)。提示RA-FLS中miR-21低表達(dá)。見表1。

    表1 正常-FLS和RA-FLS中miR-21的表達(dá)水平比較

    2.2 miR-21對(duì)RA-FLS增殖和凋亡影響 與Control組、miR-NC組比較,miR-21組RA-FLS細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平升高,細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞中C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS增殖活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖1、表2。

    圖1 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)變化

    2.3 miR-21對(duì)RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)通路的作用 與Control組、miR-NC組比較,miR-21組RA-FLS細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平均降低(P<0.05)。提示miR-21降低RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)通路激活水平。見圖2、表3。

    表2 miR-21 mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平比較

    圖2 上調(diào)miR-21對(duì)RA-FLS細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)影響

    2.4 PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑對(duì)miR-21影響RA-FLS增殖、凋亡的作用 與miR-21組比較,miR-21+

    表3 上調(diào)miR-21后RA-FLS細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平比較

    IGF-1組RA-FLS增殖活性升高,細(xì)胞凋亡率降低,細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)增多,C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)減少,Bcl-2蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。提示激活PI3K/Akt信號(hào)逆轉(zhuǎn)miR-21對(duì)RA-FLS增殖、凋亡作用。見圖3、表4。

    圖3 IGF-1對(duì)上調(diào)miR-21的RA-FLS細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)影響

    表4 表4 IGF-1上調(diào)miR-21后RA-FLS細(xì)胞增殖活性、凋亡率和細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平比較

    3 討論

    RA發(fā)病率較高,患者的關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生炎癥后,能誘導(dǎo)軟骨、骨組織損傷,最終誘導(dǎo)關(guān)節(jié)功能障礙,影響RA患者正常行動(dòng)能力和勞動(dòng)能力[17-19]。滑膜組織增生是RA發(fā)生的典型特征,雖然炎癥在滑膜襯里層中長(zhǎng)期存在,但RA-FLS過度增殖是誘導(dǎo)滑膜增生的關(guān)鍵因素[20-21]。既往研究顯示,miRNA參與RA發(fā)生,能夠影響RA-FLS生物學(xué)行為[22]。Liu等[14]研究顯示,miR-21與RA有關(guān),過表達(dá)miR-21減輕RA大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥。Hu等[15]研究結(jié)果顯示,miR-21對(duì)RA-FLS釋放炎癥因子的有抑制作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RA-FLS中miR-21表達(dá)水平降低,上調(diào)miR-21可降低RA-FLS細(xì)胞增殖活性,提示上調(diào)miR-21抑制RA-FLS增殖,這與以上的研究結(jié)果相符合,表明miR-21在RA進(jìn)展中可能扮演抑制因子的作用。

    RA患者中FLS過度增殖的同時(shí)細(xì)胞凋亡減少。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜過程,與細(xì)胞凋亡有關(guān)調(diào)控因子很多,Caspase-3是Caspase蛋白家族中的凋亡執(zhí)行因子,Caspase-3活化后形成C-Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[23]。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白,Bax屬于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白,Bcl-2屬于Bcl-2蛋白家族中的抑凋亡蛋白,二者表達(dá)改變與細(xì)胞凋亡進(jìn)程有關(guān)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-21后的RA-FLS中C-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均升高,而Bcl-2蛋白水平降低,上調(diào)miR-21誘導(dǎo)RA-FLS凋亡,這與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相一致,miR-21具有誘導(dǎo)RA-FLS凋亡的作用。

    信號(hào)通路在RA發(fā)生中作用廣泛,PI3K/Akt是在RA中過度激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平抑制RA-FLS細(xì)胞增殖[26]。miRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的作用,其可以通過調(diào)控下游信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用,并且在不同的病理或生理過程中miRNA的調(diào)控機(jī)制有差異[27]。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-21后的RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)激活水平降低,且PI3K/Akt信號(hào)激活劑可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-21抗RA-FLS增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,這進(jìn)一步說明了miR-21通過PI3K/Akt信號(hào)發(fā)揮作用。

    miR-21在RA-FLS中可能發(fā)揮保護(hù)作用,miR-21通過降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平抑制RA-FLS增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為分子靶向治療RA提供了參考思路。本研究不足之處在于,miR-21通過PI3K/Akt信號(hào)對(duì)RA具體作用機(jī)制還不明確,需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

    4 結(jié)論

    上調(diào)miR-21可抑制RA-FLS增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,機(jī)制可能與降低PI3K/Akt信號(hào)激活水平有關(guān)。

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