PM2.5通過(guò)TLR4/ROS途徑促進(jìn)多炎性小體生成誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)*

王偉 黃秋陽(yáng) 羅書 鄭文武 馮健 葉強(qiáng) 鄭舒展

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 四川 瀘州 646000；2.南充市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 四川 南充 637000；3.四川省瀘州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 四川 瀘州 646000)

大氣污染是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，特別是直徑小于或等于2.5微米的細(xì)顆粒物(Fine particulate matter,PM2.5)，是大氣中影響人類健康的主要物質(zhì)。流行病學(xué)證據(jù)表明，PM2.5可增加心血管病的發(fā)病率和死亡率[1]，大氣PM2.5年平均暴露濃度每增加10 μg/m3，心血管疾病發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)分別增加25%和16%[2]，可能與其促動(dòng)脈粥樣硬化、破壞粥樣斑塊穩(wěn)定性相關(guān)[3]，但具體作用機(jī)制有待闡明。巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的主要效應(yīng)細(xì)胞，其在粥樣斑塊中的聚集數(shù)量以及分泌炎癥因子是粥樣斑塊不穩(wěn)定的主要因素[4]。已有研究顯示PM2.5可直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，主要具有致炎效應(yīng)，可被巨噬細(xì)胞的Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)識(shí)別[5]，活化NF-κB途徑引起炎癥因子[6-7]。然而，炎癥調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，炎性小體以及活性氧(Reactive oxygen species, ROS)在其中扮演的角色不得而知。炎性小體是胞內(nèi)多蛋白復(fù)合體，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要分為NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族受體蛋白(包括不含PYD結(jié)構(gòu)域的NLRC4)和非NLR家族受體蛋白AIM2等，其促進(jìn)炎癥因子分泌在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用[8]。由于PM2.5復(fù)雜復(fù)合物的理化特性，相關(guān)炎性小體是否參與PM2.5的致炎作用研究甚少，推測(cè)PM2.5可能通過(guò)增加巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)炎癥小體的作用發(fā)揮促炎效應(yīng)，影響巨噬細(xì)胞的凋亡，從而造成斑塊的不穩(wěn)定。另外，氧化應(yīng)激在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用已被證實(shí)，因此本研究將重點(diǎn)探討多炎癥小體及ROS在PM2.5對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥與凋亡作用中的具體影響，為闡明PM2.5在動(dòng)脈粥樣硬化中的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 PM2.5樣本采集于2020年3月～6月四川省瀘州市茜草園藝路(瀘州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站提供)；RAW264.7細(xì)胞株(中喬新舟)；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天)；ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、TLR4抑制劑TAK242(索萊寶)；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)；抗GAPDH、NLRC4 抗體(Abcam)；抗NLRP3抗體(CST)；抗NLRP1(Santa)；抗AIM2抗體(Proteintech)；抗Caspase1抗體(Affbiotech)；Western blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑(ASPEN)；IL-1β、IL-18、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒(ELK Biotechnology)；ROS活性氧誘導(dǎo)劑、ROS活性氧抑制劑(Bestbio)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5混懸液制備 將PM2.5樣本置于滅菌注射用水中，使用超聲清洗器洗脫、溶解、震蕩3次，每次持續(xù)40 min，將所得洗脫溶解液紗布過(guò)濾后取過(guò)濾液，12000 r/min下離心10 min，取沉淀物低溫冷凍干燥獲得PM2.5顆粒物，再將PM2.5顆粒超聲波震蕩溶于PBS溶液中，配成終濃度100 μg/mL溶液，高溫蒸汽滅菌后放置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用PBS稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞處理 使用DMEM高糖培養(yǎng)基+5%FBS+1%青鏈霉素作為RAW264.7巨噬細(xì)胞完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿90%時(shí)進(jìn)行傳代， PBS洗滌兩次后使用一次性細(xì)胞刮刀將細(xì)胞輕輕刮離瓶底，1000 r/min離心3 min，取沉淀吹散混勻重置后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 首先確定PM2.5在不同濃度和時(shí)間下對(duì)細(xì)胞活性和凋亡的影響，PM2.5濃度梯度設(shè)為0、25、50、75和100 μg/mL；時(shí)間梯度上設(shè)6、12、18、24、36和48 h。再將細(xì)胞分成空白對(duì)照組、PM2.5組、PM2.5+TKA242組、PM2.5+ROS(-)組、PM2.5+ROS(+)組，其中空白對(duì)照組按1∶1加入等量PBS，PM2.5組加入PM2.5懸液，PM2.5+TKA242組加入PM2.5懸液和TLR4抑制劑TKA242(40 μmol/L)，PM2.5+ROS(-)組加入PM2.5懸液和ROS抑制劑(1∶500)，PM2.5+ROS(+)組加入PM2.5懸液和ROS激動(dòng)劑(1∶1000)，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。

1.2.4 CCK8細(xì)胞活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種在96孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，每組予以相應(yīng)干預(yù)后再向每孔加入10μL的CCK-8溶液，再在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm的吸光度。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 向24孔板中加入PBS洗滌細(xì)胞，一次性細(xì)胞刮刀將細(xì)胞輕輕刮離瓶底，300 r/min離心10 min棄上清，按照ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書用Binding Buffer重懸2次并稀釋細(xì)胞至1×106個(gè)/mL，Annexin V-FITC避光染色10 min,然后PI避光孵育5 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.6 ROS檢測(cè) 取各組處理好的細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌后，按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書加入10 μmol/L的DCFH-DA，37℃下孵育20 min，再用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，在488 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品吸光度。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉膜，加入一抗[TLR4、NLRP1(1∶500); NLRP3、NLRC4、AIM2、Caspase-1(1∶1000)]，4℃?zhèn)葦[搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，再加入二抗稀釋液室溫孵育2 h，用電化學(xué)發(fā)光液對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行顯影，使用AlphaEase-FC軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.2.8 ELISA檢測(cè) 取各組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液500 μL，4℃下3500 r/min離心10 min，取上清液，稀釋后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-1β、IL-18、IL-10濃度，首先梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測(cè)樣品并通過(guò)回歸方程計(jì)算樣本細(xì)胞因子濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得各組織樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)證實(shí)PM2.5對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響呈時(shí)間、劑量依賴性，即暴露24 h后PM2.5的濃度越高RAW264.7細(xì)胞的活性越低(P<0.05),同時(shí)在相同的PM2.5濃度(50 μg/mL)作用下，細(xì)胞的活性隨著PM2.5作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同PM2.5濃度及干預(yù)時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響(n=4)

2.2 PM2.5促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡 50 μg/mL的PM2.5刺激24 h后，PM2.5組較空白對(duì)照組有更高的凋亡率(P<0.05)，表明PM2.5可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡，而在PM2.5+TKA242組抑制TLR4、PM2.5+ROS(-)組抑制ROS后凋亡率低于PM2.5組(P<0.05)，而激活ROS的PM2.5+ROS(+)組凋亡率則比PM2.5組明顯上升(P<0.05)，提示PM2.5可能通過(guò)TLR4、ROS相關(guān)機(jī)制促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.3 PM2.5增加多炎性小體的表達(dá)以及促炎因子釋放 Western blot 顯示PM2.5組相較于空白對(duì)照組檢測(cè)出NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達(dá)升高(P<0.05)，Caspase-1表達(dá)也明顯增高(P<0.05)，同時(shí)ELISA顯示PM2.5組相對(duì)于空白對(duì)照組促炎因子IL-1β、IL-18分泌增加(P<0.05)，而抑炎因子IL-10則減少(P<0.05)，提示PM2.5促進(jìn)多炎性小體表達(dá)并促進(jìn)炎性因子釋放。見圖3。

2.4 PM2.5通過(guò)TLR4激活多炎性小體促進(jìn)炎性因子釋放 相對(duì)于空白對(duì)照組，PM2.5組檢測(cè)到TLR4的高表達(dá) (P<0.05)，而使用TLR4抑制劑TKA242抑制TLR4后NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達(dá)較PM2.5組下降，Caspase-1表達(dá)也降低 (P<0.05)，ELISA顯示PM2.5+TKA242組較PM2.5組促炎因子IL-1β、IL-18的分泌減少(P<0.05)。見圖4。

圖2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡率變化(n=3)

圖3 PM2.5干預(yù)下炎性小體表達(dá)(A)以及細(xì)胞因子分泌(B)情況(n=3)

圖4 PM2.5通過(guò)TLR4激活多炎性小體(A)促進(jìn)炎性因子釋放(B)(n=3)

2.5 ROS在PM2.5促巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的作用 PM2.5組ROS水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，抑制TLR4后ROS水平較PM2.5組降低(P<0.05)(圖5)，提示PM2.5可通過(guò)TLR4促進(jìn)ROS的生成。與PM2.5組比較，加入ROS抑制劑的PM2.5+ROS(-)組NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2四種炎性小體表達(dá)下降，TLR4、Caspase-1表達(dá)降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、IL-18的分泌也減少，而PM2.5+ROS(+)組加用ROS激動(dòng)劑后則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，見圖6。

圖5 各組巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)水平(n=3)

3 討論

當(dāng)前大氣環(huán)境污染備受全球關(guān)注，其中PM2.5與人類疾病密切相關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)暴露于PM2.5中會(huì)導(dǎo)致心肌梗死發(fā)生率上升[9]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也提示暴露于PM2.5會(huì)損傷心肌、增加粥樣斑塊的易損性[10-11]，而在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和穩(wěn)定過(guò)程中巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞在血管壁的堆積至關(guān)重要[4]。PM2.5經(jīng)呼吸道通過(guò)肺毛細(xì)血管進(jìn)入血液循環(huán)[12]，可改變循環(huán)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎性水平，引起系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[13]。

炎性小體激活后調(diào)節(jié)caspase-1的活化，促使多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，可刺激巨噬細(xì)胞分泌促炎因子和趨化因子，因而具有炎癥放大效應(yīng)[14]。NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2是目前研究最多的炎性小體，在調(diào)節(jié)炎癥因子產(chǎn)生過(guò)程中具有獨(dú)立或者協(xié)同的作用[8]。其中，NLRP3的活化可造成粥樣斑塊的不穩(wěn)定，有研究發(fā)現(xiàn)NLPR3可被PM2.5激活[15]，但是PM2.5成分復(fù)雜[16]，除了NLRP3，PM2.5能否激活其他炎性小體尚無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)觀察到PM2.5作用于巨噬細(xì)胞后四種炎性小體表達(dá)均增加，caspase-1表達(dá)增高，促炎因子IL-1β、IL-18分泌增加，炎癥抑制因子IL-10減少，提示PM2.5可通過(guò)激活多種炎性小體從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥效應(yīng)，但是在此過(guò)程中是否存在激活多炎性小體的共同位點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。

圖6 ROS影響下各組炎性小體表達(dá)(A)以及細(xì)胞因子分泌(B)情況(n=3)

巨噬細(xì)胞凋亡貫穿于整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程[16]，早期斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡的增加利于抑制泡沫細(xì)胞形成，而晚期粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡則會(huì)促使壞死核心形成[17]，并且觸發(fā)NLRP3活化加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[18]。本實(shí)驗(yàn)觀察到PM2.5能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。TLR4是識(shí)別病原體高度保守結(jié)構(gòu)基序的主要受體，在AS的發(fā)生發(fā)展中的作用極其重要。同時(shí)，氧化損傷與炎癥反應(yīng)都是引起內(nèi)皮功能紊亂和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的公認(rèn)的重要因素[16]，研究發(fā)現(xiàn)PM2.5可通過(guò)理化特性和經(jīng)代謝生成的ROS影響細(xì)胞[19]，而ROS也能引起炎性小體的激活、聚集[20]，ROS的產(chǎn)生也會(huì)促進(jìn)TLR4的表達(dá)，使TLR4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)效應(yīng)增強(qiáng)[16]。目前關(guān)于PM2.5對(duì)二者的共同影響鮮有報(bào)道。本研究觀察到PM2.5可刺激巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，TLR4抑制劑可抑制PM2.5對(duì)ROS的升高作用，表明PM2.5通過(guò)TLR4介導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS的生成；另一方面，使用ROS抑制劑也可削弱PM2.5對(duì)TLR4的上調(diào)作用，而加入ROS激動(dòng)劑則進(jìn)一步增加TLR4的表達(dá)，表明ROS作為 PM2.5作用于TLR4后的產(chǎn)物分子可正反饋TLR4的表達(dá)，通過(guò)上調(diào)TLR4的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)PM2.5的致炎作用。另外，ROS激動(dòng)劑可進(jìn)一步增加PM2.5促多炎癥小體的表達(dá)和炎性因子的分泌作用，而ROS抑制劑則削弱PM2.5的致炎效應(yīng)，說(shuō)明PM2.5可能通過(guò)TLR4/ROS途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡過(guò)程。

由于不同區(qū)域的PM2.5在成分上可能存在區(qū)別，對(duì)機(jī)體的影響可能存在差異，沒有采集多區(qū)域的PM2.5樣本進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)是本實(shí)驗(yàn)的不足之處，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)，未在原始細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可能與人體內(nèi)病理過(guò)程存在區(qū)別，因此下一步研究可觀察PM2.5對(duì)體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的影響及對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制探討。

4 結(jié)論

PM2.5可通過(guò)TLR4受體增加多炎性小體的表達(dá)，同時(shí)增加ROS的水平促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。