程序性低溫冷凍對自體移植牙牙周愈合的影響*

駱敬 隆元鍶 易守銀 冉娟 田鯤，3

( 1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072)

自體牙移植，是將患者的阻生智齒、錯(cuò)位牙或多生牙由一個(gè)位置移植到另一個(gè)位置，以代替缺損的牙行使功能。其治療周期短、成本低、能有效維持牙槽骨高度并且新形成的牙周膜可恢復(fù)牙齒的本體感受和溫度覺，為牙齒提供有利的生物學(xué)功能[1]，受到學(xué)者關(guān)注。既往有個(gè)案移植10年[2]、甚至20年[3]成功存活的報(bào)道，但其成功率受多種因素影響可重復(fù)性不強(qiáng)。隨著術(shù)前CBCT結(jié)合3D打印能大幅縮短供體牙口外離體時(shí)間[4]，提升成功率。自體移植牙擁有良好臨床應(yīng)用前景，但供體來源受限，常因發(fā)炎或正畸治療拔除，口內(nèi)缺牙時(shí)卻又無牙可供[5]。為擴(kuò)寬適應(yīng)癥，有學(xué)者提出低溫冷凍保存供牙的思路，通過特殊降溫措施將處于冷凍保護(hù)劑(CPA)里的活體牙齒長期凍存，使其代謝停止或者減弱到最低，升溫后恢復(fù)正常代謝能力并移植[6]。低溫冷凍或解凍過程中細(xì)胞因溶質(zhì)毒性或冰晶形成會受到不可逆的損傷。冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)制是增加系統(tǒng)中所有溶質(zhì)的總濃度，減少在任何溫度下的冰形成量，阻止冷凍或解凍過程中細(xì)胞損傷[7]。還有學(xué)者探索不同速率冷凍方法對細(xì)胞的損害大小，發(fā)現(xiàn)與快速冷凍法相比，在5%和10%二甲亞砜中，控制率冷凍法產(chǎn)生的活細(xì)胞數(shù)量顯著增加[8]。牙周愈合是決定自體移植成功與否的重要因素，保存牙周韌帶細(xì)胞是重中之重[9]。低溫冷凍牙復(fù)蘇后其牙周韌帶細(xì)胞活性與新鮮的相似[10]。但目前關(guān)于冷凍牙自體移植入牙槽窩的實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道，也沒有系統(tǒng)性的評估和分析。本實(shí)驗(yàn)用比格犬作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以冷凍保護(hù)劑輔助凍存，通過冷凍移植后臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)與組織學(xué)表現(xiàn)對比，探究低溫冷凍后牙移植的牙周預(yù)后，為進(jìn)一步的理論研究和臨床實(shí)踐積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及護(hù)理

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取1年齡成年比格犬1只，由四川省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重9 kg，保證室溫且單籠常規(guī)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 動(dòng)物護(hù)理 ①每日定時(shí)、定量喂食2次，每日更換充足清水，保證其飲用。②犬舍每日清掃，地面保持干燥，地面、臥具3%媒酚皂消毒1次/周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲亞砜(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，戊巴比妥鈉(上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，鹽酸甲哌卡因(賽特多有限公司，法國)，青霉素(陽制藥有限公司)，氯己定(哈爾濱樂泰藥業(yè)有限公司)，磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇 (江蘇海興化工有限公司)，二甲苯(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，蘇木素伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，組織固定液(多聚甲醛)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，組織脫鈣固定液(EDTA)(廣州維格斯生物科技有限公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)器材 登騰配套工具盒(Dentium公司，韓國)，自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)，轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國 )，BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)( 常州郊區(qū)中威電子儀器廠)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)，數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1. 3 方法

所有拔牙、種植器械、慢速渦輪機(jī)消毒待用，吸唾裝置連接并每次更換吸唾管。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體均按照《醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體及廢棄物處理管理辦法》進(jìn)行包裝集中處理。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵照2006年國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中的各條款進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)牙納入標(biāo)準(zhǔn)：根尖孔發(fā)育完整且牙周條件良好的健康前牙。拔除左側(cè)下頜第三側(cè)切牙置于10%二甲亞砜保存液-80℃凍存2周，程序性復(fù)蘇解凍后移植于右下頜同名牙位作為冷凍牙，左側(cè)下頜第二側(cè)切牙即刻移植于右下頜同名牙位作為對照牙。

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前拍攝比格犬X射線片，觀察實(shí)驗(yàn)牙牙根及牙槽骨的情況。術(shù)前肌注40萬單位/ kg青霉素，禁食12 h。0.3 mL/kg靜脈注射3%戊巴比妥鈉對比格犬進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉。待實(shí)驗(yàn)犬全身麻醉起效后，檢查呼吸、心跳及體溫。

1.3.2 冷凍保護(hù)劑的準(zhǔn)備 5 mL的離心管倒入10%的二甲亞砜溶液備用。

1.3.3 牙齒拔除 碘伏消毒術(shù)區(qū)，鋪巾，2%鹽酸甲哌卡因1支(1.8 mL)行口腔術(shù)區(qū)的局部浸潤麻醉，探針分離作為冷凍牙的左側(cè)下頜第三側(cè)切牙牙齦，微創(chuàng)牙挺增隙、挺松供牙，用濕生理鹽水紗布包裹住上頜雙尖牙，牙鉗鉗喙鉗住供牙牙頸部，頰舌向搖動(dòng)，沿牙長軸方向脫位，術(shù)中注意保護(hù)牙頸部及牙周膜。棉球壓迫牙槽窩止血，將供牙浸泡于離心管中待用。

1.3.4 離體牙處理 將離心管置于冰水混合物中預(yù)冷10 min，-26℃冷藏10 min，轉(zhuǎn)移置-80℃的冰箱。

1.3.5 移植就位 上述方法拔除作為對照牙的左側(cè)下頜第二側(cè)切牙，將牙浸泡于生理鹽水中待用。將冷凍2周后的離心管取出，直接37℃溫水水浴，冰塊消失后(約5 min)取出冷凍牙，生理鹽水輕柔反復(fù)沖洗去除殘留二甲亞砜，供牙備好后，拔除受植側(cè)同名牙，擴(kuò)大牙槽窩，沖洗牙槽窩備用。將第二側(cè)切牙和冷凍2周后的第三側(cè)切牙，植入對應(yīng)同名牙槽窩內(nèi)，調(diào)整咬合后十字縫線交叉固定。術(shù)后三天連續(xù)肌肉注射青霉素40萬單位/ kg。術(shù)后1周拆除縫線，后期半流質(zhì)喂食，減少飲食對移植牙愈合的影響。分別于術(shù)后即刻、1月、3月拍攝X射線片并對其牙周袋深度、松動(dòng)度及相關(guān)臨床表現(xiàn)進(jìn)行檢查記錄。

1.3.6 Micro-CT掃描 術(shù)后3月用過量麻醉法處死比格犬，用骨鋸截取術(shù)區(qū)移植牙及牙槽骨，置于4%多聚甲醛溶液中固定。多聚甲醛浸泡72 h后生理鹽水及0.01 mol/L PBS 緩沖液(pH=7.2) 沖洗浸泡組織塊3次，每次5 min，75%的酒精溶液保存、運(yùn)輸。掃描前校對儀器，將標(biāo)本取出放入容器中并固定，保持牙長軸與掃描床平行、與掃描平面垂直。從牙尖掃描至根尖牙槽骨,運(yùn)用Micro CT(SCANCO VivaCT 40)在30-70KvP及160μA條件下，設(shè)置獲取圖層間距為0.019 mm，micro-CT vision 6.1軟件重建后，獲得樣本的頰舌向切面圖像，以DICOM格式整體輸出重組后導(dǎo)入Mimics17軟件，進(jìn)行分析。

1.3.7 組織切片制備 將樣本放置在4%的多聚甲醛固定液中固定7 d， PBS緩沖液洗凈多聚甲醛。之后置于10%乙二胺四乙酸(EDTA)中并以37℃恒溫水箱孵育，4～5天更換一次脫鈣液。1月后取出樣本，蒸餾水反復(fù)漂洗，依次以濃度60%、70%、80%、95%的乙醇梯度脫水。脫水后的樣本置于透明劑二甲苯中，液體石蠟浸泡，60℃恒溫箱保存2～3 d，石蠟包埋。標(biāo)本按平行牙長軸方向做頰舌向連續(xù)組織切片，染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，重復(fù)3次，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，后入蒸餾水，最后蘇木素伊紅染色，二甲苯透明處理三次后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。見圖1。

圖1 移植和受植牙位

2 結(jié)果

2.1 冷凍牙和對照牙的X線片比較 術(shù)后即刻X射線片顯示制備的兩牙牙槽窩與移植牙貼合緊密，未見明顯牙周膜間隙。術(shù)后1月兩牙牙齦緣輕微紅腫、BOP+、松Ⅰ°，未探及明顯牙周袋，未見瘺道，無牙周溢膿，X 射線片示根尖周未見明顯低密度透射影像，無牙根內(nèi)外吸收影像。術(shù)后3月兩牙牙齦紅腫，BOP+、松Ⅰ-Ⅱ°，探及輕度牙周袋(3～5 mm)，未見瘺道，無牙周溢膿，X 射線片示兩牙牙根表面出現(xiàn)不同程度凹陷性吸收，牙槽骨吸收至根中1/3處，冷凍牙近中根尖處牙骨質(zhì)可見明顯吸收，根尖處可見低密度透射影，無牙根內(nèi)吸收影像。見圖2。

圖2 移植牙術(shù)后1月、3月的X片

2.2 冷凍牙與對照牙Micro-CT掃描比較 冷凍移植牙術(shù)后3月牙根表面出現(xiàn)多處吸收影像，范圍較大處波及牙本質(zhì)，并伴有根尖部牙槽骨吸收，牙體與牙槽骨周圍間隙明顯增寬；即刻移植牙術(shù)后3月牙根表面略微粗糙，局部有微小淺表性吸收，牙體與牙槽骨周圍未見明顯間隙，根尖區(qū)無透射影。見圖3。

2.3 冷凍牙和對照牙的HE染色比較 術(shù)后3月冷凍牙可見牙根表面牙骨質(zhì)吸收嚴(yán)重，吸收窩內(nèi)肉芽組織長入，破骨細(xì)胞活躍，吸收處表面可見有新骨形成并埋入再生牙周膜纖維形成上皮再附著，但其上皮再附著松弛，周圍纖維走行不規(guī)則。術(shù)后3月對照牙牙根表面吸收相對較輕，且牙頸部結(jié)合上皮再附著寬度相較實(shí)驗(yàn)牙更寬、更致密，牙周膜纖維走行也較冷凍牙更規(guī)則。見圖4。

圖3 移植牙術(shù)后3月Micro-CT切面

圖4 移植牙術(shù)后3月組織學(xué)HE染色切片

3 討論

據(jù)報(bào)道，自體移植牙的存活率為90%～95%不等，20～40年后與正常牙的存活率基本相同，功能與正常牙齒相當(dāng)[11]。然而作為供牙的第三磨牙常被提前拔除，限制了牙移植的臨床應(yīng)用，Politis等[11]提出牙庫的概念，通過低溫冷凍的方法保存供牙，Kaku等[12]證明從解凍后的牙齒中分離出來的牙髓細(xì)胞保留了73%的生存能力，解凍后的牙周韌帶細(xì)胞的增殖能力與新鮮的相似。為冷凍移植提供了組織學(xué)依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷與冷凍保護(hù)劑有關(guān)，文獻(xiàn)表明5%～10%二甲基亞砜效果作為冷凍保護(hù)劑的效果較好[8]。然而，也有一些文獻(xiàn)表示加入冷凍保護(hù)劑復(fù)溫后的牙易出現(xiàn)二甲亞砜效應(yīng)，對其細(xì)胞毒性和相關(guān)副作用的擔(dān)憂[13]，但對于移植牙來說，該效應(yīng)大部分是可耐受，也是可逆的[14]?？赏ㄟ^再植前PBS緩沖液反復(fù)多次沖洗殘留的保護(hù)劑來減少毒性[15]。降溫速率也是影響冷凍損傷大小的重要因素。采用過快的速度降溫時(shí)，細(xì)胞膜的通透性限制了胞內(nèi)水分子流向胞外，最終胞內(nèi)形成冰晶撐破細(xì)胞結(jié)構(gòu)；相反，冷凍速度過慢，細(xì)胞內(nèi)水分子有足夠時(shí)間流出導(dǎo)致細(xì)胞脫水發(fā)生收縮，高滲透壓、高離子濃度的有害環(huán)境促使細(xì)胞受到滲透性損傷[16]。細(xì)胞的皺縮極限是自身體積的55%，進(jìn)一步的皺縮會使細(xì)胞逐步喪失功能，最終細(xì)胞死亡。在常用低溫冷凍的程序性降溫、快速降溫、玻璃化冷凍三種程序中，程序性降溫和玻璃化冷凍效果優(yōu)于快速降溫，復(fù)蘇后活細(xì)胞數(shù)量較多[8,17]，但操作煩瑣、費(fèi)時(shí)，需專門的程序控制冷凍儀，成本高。Davies等[18]提出一種更簡單、更便宜的替代方法：將組織或細(xì)胞樣本首先預(yù)冷到4℃，隨后直接沉積在-80℃的冰箱或液氮中。目前研究表明，此種無控制速率的冷凍方法能有效長期凍存牙髓干細(xì)胞，解凍細(xì)胞活力、多能性、增殖和分化均無影響[19]，本研究采用上述簡易冷凍方法并稍加調(diào)整，中途增加一冷凍階段(4℃到-80℃中間增加-26℃冷藏10 min)，使其更接近慢速冷凍。目前關(guān)于最佳解凍方式或解凍溫度的研究文獻(xiàn)很少，在復(fù)溫過程中存在兩個(gè)問題：①反晶化即復(fù)溫過程中冰晶形成和生長的過程。②裂紋形成即由于緩慢且不均勻的升溫速率，產(chǎn)生差異應(yīng)力所致。對于凍存組織的解凍，大量的研究證明，快速均勻復(fù)溫是最為有效的[20]。其中使用最廣泛的便是37℃水浴復(fù)蘇，可以有效地去除冰晶，將細(xì)胞潛在損傷能降到最小[21]。

本研究兩牙術(shù)后出現(xiàn)的牙周癥狀多考慮為移植后比格犬口腔衛(wèi)生控制較差，沒有良好的自潔手段，術(shù)后縫線增加食物殘?jiān)逊e，牙菌斑形成，造成早期牙齦炎，牙齦紅腫，隨時(shí)間進(jìn)展菌斑未得到有效去除，使得炎癥未得到一定控制后進(jìn)展為牙周炎，引起牙槽骨吸收，牙周組織破壞，牙周袋形成。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)在比格犬移植術(shù)后，加強(qiáng)對移植牙牙周維護(hù)(如牙周沖洗、上藥、牙周刮治等)。組織切片及影像學(xué)表現(xiàn)的牙根吸收多由于拔牙(牙鉗鉗喙用力過度致牙周膜細(xì)胞損害、牙骨質(zhì)破裂)、移植(試窩時(shí)間過長、試窩過程中對牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械損傷)過程中牙周膜受到損傷或炎癥刺激，引起巨噬細(xì)胞趨化因子、破骨細(xì)胞激活因子和前列腺素釋放增加。造成牙周膜和骨髓來源的循環(huán)單核造血前體細(xì)胞在上述因子刺激下向破牙/破骨細(xì)胞分化，從而引起牙根吸收[22]。加上實(shí)驗(yàn)牙冷凍和解凍過程中對牙周膜細(xì)胞造成的不可逆損傷，使得冷凍牙牙根吸收更加嚴(yán)重。移植牙體外操作時(shí)間過長也是影響牙根外吸收的重要原因，研究表明應(yīng)盡量將操作時(shí)間控制在10 min以內(nèi)，也有少許報(bào)道體外操作時(shí)間超過15 min移植牙依然存活并且得到良好牙周膜愈合的病例[23]。為了防止拔牙的損傷，在拔牙時(shí)應(yīng)輕柔用力，同時(shí)可以在鉗喙上包裹濕生理鹽水紗布。預(yù)備移植窩前可結(jié)合3D打印技術(shù)，打印移植牙試窩從而提前預(yù)備出合適大小形狀的移植窩，避免試窩時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械損傷及減少移植牙離體操作時(shí)間。組織切片表現(xiàn)的牙根吸收處新骨形成則表明了移植后冷凍牙牙周膜和對照牙一樣具有活性能誘導(dǎo)牙周再生，成牙骨質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)新骨形成并埋入再生牙周膜纖維形成上皮再附著，但由于低溫冷凍對牙周膜細(xì)胞造成不可復(fù)性損傷使得其牙周愈合較對照牙稍差。 以上結(jié)果表明-80℃冷凍保存后的牙齒移植后在短期內(nèi)牙周愈合效果是可以預(yù)期的，但隨著觀察時(shí)間延長其牙周預(yù)后較對照牙差，但本實(shí)驗(yàn)研究樣本小且觀察時(shí)間短，存在偶然性，觀察指標(biāo)單一，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)需加大樣本量、延長觀察時(shí)間并增加檢測手段檢測移植牙牙周膜活性，對可能影響因素分別進(jìn)行評估。雖然目前冷凍牙移植研究進(jìn)展緩慢，但仍具有很廣闊的研究前景，目前鮮有關(guān)于-80℃保存冷凍牙的相關(guān)報(bào)道，本研究結(jié)果為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的開展打下基礎(chǔ)，這對于治療牙列缺損這一常見疾病有著重要的意義。

4 結(jié)論

低溫冷凍保存后的移植牙在短期內(nèi)具有一定的牙周愈合潛力，但是在長期的觀察中出現(xiàn)牙根、牙槽骨吸收，這可能與冷凍解凍方法、冷凍保護(hù)劑選擇、術(shù)中機(jī)械損傷、離體操作時(shí)間等有關(guān)，后續(xù)研究需要進(jìn)一步加大樣本量，控制可能影響因素。冷凍牙移植具有很廣闊的研究前景，關(guān)于最適合它的冷凍方法、選用哪些種類的冷凍保護(hù)劑以及冷凍保護(hù)劑的不同濃度需要更多的研究，以期移植后能長期存活。