鐵死亡在實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張大鼠睪丸中的初步探討*

王浩浩 李海松 王繼升 趙琦 徐洪勝 韓亮

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院，北京 102400)

鐵死亡(Ferroptosis)是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡形式，該死亡方式依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，以脂質(zhì)過(guò)氧化為特征[1]。鐵死亡與多種疾病密切相關(guān)，很多領(lǐng)域都已經(jīng)證實(shí)了細(xì)胞的鐵死亡形式，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病以及腫瘤等[2]，但是在生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究仍較為缺乏。精索靜脈曲張(Varicocele，VC)是男科臨床中的常見(jiàn)病、多發(fā)病，能夠影響到睪丸的生精功能，導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，引起男性不育[3]。目前VC導(dǎo)致男性生精功能下降的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Gholirad等[4]研究表明，由于血流減少和睪丸溫度升高，VC大鼠的睪丸中ROS含量升高，并沉積了過(guò)量的鐵。基于這一觀察結(jié)果，本研究推測(cè)VC可能引起大鼠睪丸中生精細(xì)胞鐵死亡的增加從而導(dǎo)致了生精功能障礙。為了驗(yàn)證推測(cè)，本研究建立了實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張(Experimental left varicocele，ELV)大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)鐵死亡相關(guān)指標(biāo)含量和相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)水平，探討細(xì)胞鐵死亡方式是否參與ELV睪丸損傷的病理過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24只8周SD大鼠(購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司)，SPF級(jí)，體重240～260 g，使用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)分組，手術(shù)A組和手術(shù)B組各6只，設(shè)假手術(shù)A組和假手術(shù)B組各6只作為對(duì)照。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在同樣的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)大鼠處理符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 主要儀器與試劑 游標(biāo)卡尺(日本三量)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)、成像系統(tǒng)(日本尼康)。ROS測(cè)定試劑盒(北京雅安達(dá))、谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(Glutathione peroxidase，GPX4)檢測(cè)試劑盒(南京建成)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)測(cè)定試劑盒(南京建成)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)測(cè)定試劑盒(南京建成)。兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nuclear factor E2 related factor2,Nrf2)抗體(Cell Signaling Technology公司)、RIPA裂解液(索萊寶)、30%丙烯酰胺(索萊寶)、預(yù)染蛋白marker(Thermo公司)、PVDF膜(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立模型 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥(45 mL/kg)麻醉，腹部正中縱向切口，手術(shù)A組和手術(shù)B組參照Turner[5]經(jīng)典造模方法，分離近下腔靜脈的左腎靜脈段，于左精索靜脈和腎上腺靜脈內(nèi)側(cè)、下腔靜脈外側(cè)置一直徑約0.8 mm的改良后的金屬桿，用4-0絲線將金屬桿與左腎靜脈一并結(jié)扎后拔出此桿，造成左腎靜脈部分狹窄，同時(shí)將其余可見(jiàn)到的左側(cè)睪丸靜脈側(cè)枝回流分離后完全結(jié)扎；假手術(shù)A組和假手術(shù)B組僅行左腎靜脈分離但不結(jié)扎。術(shù)后動(dòng)物連續(xù)7 d腹腔注射20萬(wàn)單位青霉素鈉預(yù)防感染。

1.3.2 標(biāo)本采集 假手術(shù)A組和手術(shù)A組于造模2周后進(jìn)行取材，假手術(shù)B組和手術(shù)B組于造模4周后進(jìn)行取材。取材時(shí)首先對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，然后剖腹觀察，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量左側(cè)精索靜脈直徑，以左精索靜脈比術(shù)前曲張2倍以上，且雙側(cè)腎臟無(wú)明顯病變?yōu)檫x取標(biāo)準(zhǔn)，分別取出各組左側(cè)睪丸。

1.3.3 HE染色 取所有大鼠左側(cè)睪丸組織，生理鹽水沖洗，投入10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，制成切片。石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗；切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5 min；伊紅染色至橘紅色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察各組大鼠左側(cè)睪丸組織結(jié)構(gòu)的病理改變。

1.3.4 睪丸組織ROS、GSH、GSH-PX、GPX4檢測(cè) 將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10 min取上清，制備組織勻漿。采用ELISA法測(cè)定ROS、GPX4濃度，分光光度法測(cè)定GSH活性，比色法測(cè)定GSH-PX活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)睪丸組織中Nrf2蛋白表達(dá) 把組織剪切成細(xì)小的碎片，裂解液充分裂解，用玻璃勻漿器抽提總蛋白；制備SDS-PAGE 膠，電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入兔抗大鼠Nrf2抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌，最后以ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)下掃描拍照，以β-actin為對(duì)照，運(yùn)用Image J軟件測(cè)定每個(gè)樣本蛋白條帶灰度值，并計(jì)算其與β-actin條帶灰度值之比，以其比值作為Nrf2蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ELV情況比較 手術(shù)A組和手術(shù)B組共12只SD大鼠經(jīng)深度麻醉處死后，均見(jiàn)左側(cè)精索靜脈擴(kuò)張且左腎無(wú)萎縮，測(cè)量?jī)山M精索靜脈直徑與相對(duì)應(yīng)的假手術(shù)A組和假手術(shù)B組對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示建模成功。假手術(shù)A組和假手術(shù)B組則均未見(jiàn)左側(cè)精索靜脈擴(kuò)張，左腎亦未見(jiàn)萎縮。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠左側(cè)精索靜脈直徑比較

2.2 各組大鼠左側(cè)睪丸形態(tài)學(xué)變化比較 假手術(shù)A組和假手術(shù)B組大鼠左側(cè)睪丸生精小管形態(tài)正常，各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊，層次分明，結(jié)構(gòu)清晰，管腔完整，精子釋放好，管腔內(nèi)見(jiàn)大量精子，支持細(xì)胞形態(tài)良好，間隙較緊密。手術(shù)A組大鼠左側(cè)睪丸生精小管基膜損傷、變薄，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，管腔有脫落的生精細(xì)胞，管腔間隙增大，管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，支持細(xì)胞形態(tài)欠佳。手術(shù)B組大鼠左側(cè)睪丸生精小管界膜增厚、褶皺，基膜變薄，生精細(xì)胞排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞廣泛脫落，精子細(xì)胞發(fā)育不良，精子生產(chǎn)低下，管腔內(nèi)精子少見(jiàn)，支持細(xì)胞形態(tài)萎縮。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠左側(cè)睪丸組織形態(tài)學(xué)改變比較(HE 100×)

2.3 各組大鼠左側(cè)睪丸組織中ROS、GSH-PX、GPX4檢測(cè)結(jié)果比較 與相對(duì)應(yīng)的假手術(shù)A組和假手術(shù)B組相比，手術(shù)A組和手術(shù)B組大鼠左側(cè)睪丸組織中ROS濃度均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但GSH、GSH-PX活性與GPX4濃度均變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠左側(cè)睪丸組織中ROS、GSH、GSH-PX、GPX4檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 各組大鼠左側(cè)睪丸組織中Nrf2蛋白表達(dá)比較 與相對(duì)應(yīng)的假手術(shù)A組和假手術(shù)B組相比，手術(shù)A組和手術(shù)B組大鼠左側(cè)睪丸組織中Nrf2蛋白變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠左側(cè)睪丸組織中Nrf2蛋白表達(dá)情況

3 討論

世界衛(wèi)生組織將VC列為男性不育的首要原因，目前研究發(fā)現(xiàn)VC的睪丸中廣泛存在氧化應(yīng)激現(xiàn)象[6]。氧化應(yīng)激是指ROS和抗氧化劑水平失衡。ROS是一類具有高度活性的含氧基團(tuán)，是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，包括過(guò)氧化氫、超氧化物、羥基、一氧化氮和二氧化氮等。生理?xiàng)l件下機(jī)體可產(chǎn)生一定程度的受控的ROS，這些ROS不僅對(duì)維持細(xì)胞代謝正常的環(huán)境非常重要，而且在精子成熟過(guò)程中起重要作用，如精子的獲能和頂體反應(yīng)，同時(shí)精漿內(nèi)還存在著超氧化歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽氧化還原酶等對(duì)抗活性氧的酶清除系統(tǒng)，在生理情況下ROS的產(chǎn)生與對(duì)抗活性氧的酶清除系統(tǒng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡，維持著正常的生精過(guò)程[7]。如果這種平衡被破壞，則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，過(guò)量的ROS可通過(guò)直接氧化損傷精子的質(zhì)膜，導(dǎo)致生精細(xì)胞或精子DNA單鏈或雙鏈破壞、斷裂，DNA完整性受損，生精細(xì)胞也受到損傷，引起不育或發(fā)生胚胎缺陷[8]。多位學(xué)者研究[9-10]均發(fā)現(xiàn)VC時(shí)睪丸中的ROS明顯升高，且與其嚴(yán)重程度呈正比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，與相對(duì)應(yīng)的假手術(shù)A組和假手術(shù)B組相比，手術(shù)A組和手術(shù)B組ROS含量均明顯升高，說(shuō)明VC形成后精索靜脈曲張大鼠睪丸內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激可能被激活。

氧化應(yīng)激可以啟動(dòng)不同的細(xì)胞死亡途徑，如凋亡、壞死以及鐵死亡[11]。鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種獨(dú)特的調(diào)節(jié)機(jī)制，和其他形式的細(xì)胞死亡形式不同，它的典型特征是鐵依賴的脂質(zhì)活性氧增加[12]。谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(System Xc-)/GSH/GPX4軸是哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)之一，被認(rèn)為在防止脂質(zhì)過(guò)氧化介導(dǎo)的鐵死亡中起著重要作用[13]。System Xc-能夠高度特異性攝取胱氨酸，然后被GSH或硫氧還蛋白還原酶1還原為半胱氨酸，半胱氨酸反過(guò)來(lái)能夠合成GSH[14]。GSH是重要的抗氧化劑，它可清除超氧根離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、過(guò)氧化物(LOOH)。GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，它能夠特異的催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)[15]。GSH是GPX4蛋白的輔助因子和合成底物，是GPX4蛋白發(fā)揮脂質(zhì)修復(fù)功能所必需的[16]。GPX4是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它是一種脂質(zhì)修復(fù)酶，在產(chǎn)生脂質(zhì)信使分子通路中發(fā)揮重要功能，主要負(fù)責(zé)降解脂質(zhì)過(guò)氧化物，移除有毒性的中間產(chǎn)物，通過(guò)將脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒脂質(zhì)來(lái)抵抗鐵和氧依賴性的脂質(zhì)過(guò)氧化[17]。GPX4的表達(dá)受Nrf2的調(diào)節(jié)，Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，具有抗炎、抗癌、維持細(xì)胞氧化還原平衡等功能[18]。本研究結(jié)果顯示，與相對(duì)應(yīng)的假手術(shù)A組和假手術(shù)B組相比，手術(shù)A組和手術(shù)B組Nrf2蛋白表達(dá)、GSH和GSH-PX活性以及GPX4濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在兩手術(shù)組中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)和鐵死亡相關(guān)的System Xc-/GSH/GPX4軸抗氧化系統(tǒng)的明顯變化，說(shuō)明暫時(shí)不能確定VC睪丸中生精細(xì)胞存在鐵死亡的形式，氧化應(yīng)激引起的生精功能障礙可能和細(xì)胞其他的死亡方式有關(guān)。

綜上所述，雖然本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，無(wú)法得出VC睪丸中生精細(xì)胞存在鐵死亡的形式，但是仍然不能確切的否認(rèn)其存在的可能。首先鐵死亡過(guò)程不僅受System Xc--/GSH/GPX4軸影響，還受鐵代謝途徑、p53/SAT1/ALOX15通路、轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)等調(diào)控[19-22]，而本實(shí)驗(yàn)研究中檢測(cè)調(diào)控鐵死亡相關(guān)途徑的敏感基因有限，除了Nrf2、GSH、GSH-PX、GPX4外，鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)、溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)等[23]其他相關(guān)的調(diào)控基因都沒(méi)有得到檢測(cè)，而且僅測(cè)了Nrf2的蛋白表達(dá)，其他指標(biāo)的蛋白表達(dá)也沒(méi)有檢測(cè)。其次可能和VC形成的時(shí)間有一定的關(guān)系，在VC形成過(guò)程中睪丸并不均勻地受到應(yīng)激反應(yīng)的影響，雖然一些睪丸區(qū)域受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致生精小管破壞、精子生成停滯，但睪丸的其他部分可能受到的損害較小，仍然能夠支持精子生成[24]，在這種情況下，睪丸損傷區(qū)域的分子變化有可能被輕度損傷區(qū)域所彌補(bǔ)，可能會(huì)掩蓋鐵死亡經(jīng)典分子標(biāo)志物的檢測(cè)。這也解釋了為什么臨床中只一部分VC患者可以生育，而有的患者卻不能生育。未來(lái)在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，希望能夠進(jìn)一步完善鐵死亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)，深入探討睪丸生精細(xì)胞鐵死亡的形式。

4 結(jié)論

精索靜脈曲張睪丸中活性氧含量增加，氧化應(yīng)激可能被激活，但是否啟動(dòng)了鐵死亡的細(xì)胞死亡方式目前仍不能確定，尚需進(jìn)一步深入研究。