多精受精中人卵丘顆粒細(xì)胞差異基因表達(dá)分析

王麗，趙杰*，陳秀娟，杜琛，劉芳，何江峰，梅步俊

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010030；3.河套學(xué)院，巴彥淖爾 015000)

自1978年首例試管嬰兒?jiǎn)柺酪詠?，輔助生殖技術(shù)(ART)得到了快速發(fā)展，促排卵、IVF及胚胎體外培養(yǎng)方面的技術(shù)水平也在不斷提高，但仍然無法避免常規(guī)IVF中出現(xiàn)的多原核(PN)現(xiàn)象。多PN合子的出現(xiàn)會(huì)降低卵母細(xì)胞利用率、減少可利用胚胎數(shù)量、降低患者妊娠機(jī)會(huì)[1]。在卵母細(xì)胞和卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞及卵泡內(nèi)微環(huán)境會(huì)進(jìn)行雙向的信號(hào)傳導(dǎo)，促使卵母細(xì)胞發(fā)育與成熟[2]；卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的密切關(guān)系使得顆粒細(xì)胞中差異基因的表達(dá)會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，進(jìn)而影響到卵母細(xì)胞的受精情況。本研究通過分離受精前卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞，再根據(jù)卵母細(xì)胞的受精情況分為正常受精組與多精受精組，檢測(cè)正常受精和多精受精前顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)情況，以期發(fā)現(xiàn)在多精受精中差異表達(dá)的基因。

資料與方法

一、研究對(duì)象

篩選2019年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因輸卵管因素導(dǎo)致繼發(fā)不孕而進(jìn)行IVF-ET的病例3例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡25～26歲，月經(jīng)周期正常，基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)≥7個(gè)，基礎(chǔ)FSH(bFSH)值在5～10 U/L之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方為卵巢低反應(yīng)者；(2)女方患有糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾病；(3)存在子宮畸形、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮粘膜下肌瘤等婦科疾?。?4)女方診斷為輸卵管積水；(5)夫婦一方患有其他系統(tǒng)器質(zhì)性疾病；(6)夫婦中任何一方有染色體異常。男方精液質(zhì)量符合《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)正常標(biāo)準(zhǔn)要求。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)審批通過，患者經(jīng)充分知情同意后簽署知情同意書，自愿捐贈(zèng)部分顆粒細(xì)胞用于科學(xué)研究。

納入研究的卵冠丘復(fù)合體(OCCC)根據(jù)卵母細(xì)胞受精情況分為多精受精組和正常受精組。多精受精組即將同一患者的多PN受精，含2個(gè)極體(2Pb)+3PN及3PN以上的卵母細(xì)胞對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞合并為一管，按照患者姓氏區(qū)分分別標(biāo)記為MAF1、WAF2、LAF3；正常受精組即將同一患者正常受精(2Pb+2PN)的卵母細(xì)胞對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行合并，分別標(biāo)記為MNF1、WNF2、LNF3。

二、研究方法

1.取卵、授精、培養(yǎng)與觀察：促排卵方案按照內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案進(jìn)行，于月經(jīng)周期第21天開始每天肌肉注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)菲林，Ipsen Pharman Biotech，荷蘭)0.1 mg，14 d后，當(dāng)卵泡大小接近且直徑均<5 mm、E2<146.8 pmol/L、LH<10 U/L、FSH<10 U/L、子宮內(nèi)膜厚度<5 mm時(shí)，給予皮下注射重組卵泡刺激素(果納芬，默克，瑞典)75～225 U，進(jìn)行促排卵。定期進(jìn)行陰道超聲檢查，并測(cè)定血E2和孕酮(P)水平，評(píng)估卵泡發(fā)育情況。當(dāng)B超觀察到雙側(cè)卵巢中有1～2個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下吸出卵泡內(nèi)卵泡液及OCCC。將吸出的包含OCCC的卵泡液快速送至胚胎實(shí)驗(yàn)室，在體視顯微鏡下用巴斯德吸管取出OCCC，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌4遍后，放入含1 ml IVF-Plus受精液(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿中，37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h等待授精。精液采用密度梯度離心法聯(lián)合上游法進(jìn)行分離，分離后的精液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整精子密度為1×106條/ml前向運(yùn)動(dòng)精子，室溫放置。卵母細(xì)胞培養(yǎng)3～4 h后，將精子懸液制作成100 μl的微滴，精子濃度為10～20萬條/ml，將切割后的OCCC加入精子微滴中，共同過夜培養(yǎng)17 h，用拆卵管將卵母細(xì)胞周圍顆粒細(xì)胞拆除，將受精卵轉(zhuǎn)入G1-plus(Vitrolife，瑞典)微滴中，倒置顯微鏡下觀察PN及Pb排出情況并記錄，其中2Pb+2PN的受精卵為正常受精，2Pb+3個(gè)或以上PN的受精卵為多精受精。微滴繼續(xù)培養(yǎng)，加精后40 h觀察受精卵的卵裂情況，加精后64 h觀察胚胎發(fā)育情況并評(píng)級(jí)，對(duì)可移植胚胎進(jìn)行移植、冷凍或囊胚培養(yǎng)。

2.顆粒細(xì)胞的采集：在授精前10 min，用機(jī)械方法對(duì)受試者的卵母細(xì)胞外圍部分顆粒細(xì)胞進(jìn)行切割，獲取顆粒細(xì)胞團(tuán)塊，用含80 U/ml透明質(zhì)酸酶的MOPs+5%HSA液體消化1 min，離心、洗滌兩遍，分裝入0.2 ml無菌管，-80℃冷凍保存。包裹有卵母細(xì)胞的OCCC進(jìn)行微滴授精。

3. 總mRNA提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析：總mRNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序按照北京諾禾致源科技股份有限公司標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。差異表達(dá)基因篩選采用軟件DESeq操作，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用GOseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的基因本體論(GO)分析，P<0.05時(shí)表示在該GO條目顯著富集；并進(jìn)行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05時(shí)表示差異基因在該KEGG中顯著富集[3]。應(yīng)用STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org/)中的互作關(guān)系進(jìn)行差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析。

結(jié) 果

一、3例患者多精受精的發(fā)生情況

3例患者中，第1例M患者獲卵16枚，正常受精13枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入MNF1管)，多精受精3枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入MAF1管)；第2例W患者獲卵13枚，正常受精10枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入WNF2管)，多精受精2枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入WAF2管)；第3例L患者獲卵15枚，正常受精11枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入LNF3管)，多精受精3枚(對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞納入LAF3管)。第2、3例患者中單PN受精或晚卵裂受精的情況未納入統(tǒng)計(jì)。

二、兩組之間差異表達(dá)的基因

1.樣本生物信息學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)對(duì)6個(gè)樣本的cDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，得到部分原始數(shù)據(jù)與去雜后的數(shù)據(jù)信息，詳見表1。多精受精組與正常受精組比較，存在的差異表達(dá)基因共139個(gè)，其中顯著上調(diào)的基因106個(gè)，顯著下調(diào)的基因33個(gè)(圖1)。顯著上調(diào)及顯著下調(diào)的前10個(gè)基因信息詳見表2、表3。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估情況

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍(lán)色：無顯著性差異表達(dá)的基因。圖1 三名患者中多精受精組與正常受精組比較差異基因表達(dá)火山圖

表2 多精受精組與正常受精組比較顯著上調(diào)的Top10基因信息

表3 多精受精組與正常受精組比較顯著下調(diào)的Top10基因信息

2.同一患者中多精受精組與正常受精組比較：MAF1與MNF1比較，存在顯著表達(dá)差異的基因有694個(gè)，其中207個(gè)基因上調(diào)，487個(gè)基因下調(diào)(圖2)；WAF2與WNF2比較，存在顯著表達(dá)差異的基因有886個(gè)，其中596個(gè)基因上調(diào)，290個(gè)基因下調(diào)(圖3)；LAF3與LNF3比較，存在顯著表達(dá)差異的基因有805個(gè)，其中498個(gè)基因上調(diào)，307個(gè)基因下調(diào)(圖4)。

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍(lán)色：無顯著性差異表達(dá)的基因。圖2 MAF1與MNF1比較差異基因表達(dá)火山圖

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍(lán)色：無顯著性差異表達(dá)的基因。圖3 WAF2與WNF2比較差異基因表達(dá)火山圖

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；藍(lán)色：無顯著差異表達(dá)的基因。圖4 LAF3與LNF3比較差異基因表達(dá)火山圖

三、差異表達(dá)基因GO及KEGG分析

對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋，分析結(jié)果顯示，其分子功能主要參與轉(zhuǎn)錄因子活性(GO0003712)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(GO0000989)、蛋白質(zhì)鏈接(GO0000988)，生物過程主要參與細(xì)胞分化(GO030154)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(GO0007267)(圖5)。KEGG富集分析顯示，差異表達(dá)基因信號(hào)通路在核糖體(hsa03010)、細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060)、細(xì)胞分化(hsa04380)、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(hsa00270)等通路上富集(圖6)。上調(diào)的差異基因主要涉及P53信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路和HIPPO信號(hào)通路。表達(dá)上調(diào)的基因BMP2、SESN3、CDK6、GRLF1(ARHGAP35)與多精受精相關(guān)。

紅色：上調(diào)基因；藍(lán)色：下調(diào)基因。圖5 存在差異表達(dá)的基因功能注釋

圖6 差異基因KEGG富集分析(橙色表示富集的基因)

討 論

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在體內(nèi)生理?xiàng)l件下發(fā)生多精受精的幾率較低，但在體外操作下，多精受精發(fā)生的幾率較高。過往的研究多集中在臨床操作的技術(shù)及方法上，且由于人類卵母細(xì)胞不易獲得及倫理的限制，因此對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)生多精受精的機(jī)制進(jìn)行基因水平的研究很少。因卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞通過縫隙連接進(jìn)行雙向的信號(hào)交流[4-9]，所以通過研究與卵母細(xì)胞有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的卵丘顆粒細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平差異或許可以為研究卵母細(xì)胞的多精受精原理提供另外一條思路。

體外操作中多PN卵母細(xì)胞的出現(xiàn)可能是由于多條精子入卵、卵母細(xì)胞第二極體未排出、PN碎裂、入卵精子多倍體等原因造成的。這些情況的發(fā)生與卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟度異常、卵母細(xì)胞透明帶異常、卵泡液中激素水平過高或過低導(dǎo)致的卵母細(xì)胞異常以及精子濃度過高、體外培養(yǎng)條件不適導(dǎo)致的操作異常有關(guān)。

精子入卵后，卵母細(xì)胞會(huì)發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)從而阻止多精入卵，若卵母細(xì)胞成熟度不足或過熟，皮質(zhì)反應(yīng)容易發(fā)生異常。未成熟卵母細(xì)胞由于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜與透明帶未發(fā)育成熟而不能發(fā)生徹底的皮質(zhì)反應(yīng)與透明帶反應(yīng)；但卵母細(xì)胞過熟后會(huì)使皮質(zhì)顆粒內(nèi)容物排出，皮質(zhì)反應(yīng)發(fā)生不全，導(dǎo)致多精受精。本研究中，多精受精組中與卵母細(xì)胞成熟度相關(guān)的差異基因有CDK6、BMP2基因。CDK基因家族參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄，對(duì)卵母細(xì)胞的核成熟和轉(zhuǎn)錄活性具有重要作用，是恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重要物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期進(jìn)程[10-12]。作為BMP亞家族、TGF-β超家族的成員之一，BMP2與GDF9一起在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮作用[13]，BMP2與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并通過HIPPO信號(hào)通路BMPs-Smad1/4系統(tǒng)使Smad1/4磷酸化，影響卵母細(xì)胞受精，BMP2水平可作為卵母細(xì)胞質(zhì)量與受精的預(yù)測(cè)指標(biāo)[14-16]。

MDM2-p53-SESN信號(hào)通路可能通過SESN3基因調(diào)控卵母細(xì)胞氧化、衰老以及DNA損傷和修復(fù)過程。PI3K/AKT信號(hào)通路中PI3K激活磷酸化并進(jìn)一步激活A(yù)KT，其定位于細(xì)胞膜，與細(xì)胞靜止、增殖有關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)育并改善細(xì)胞增殖從而影響卵母細(xì)胞受精。。

p53基因是重要的腫瘤抑制基因之一[17-19]，在多個(gè)通路中發(fā)揮作用。在MDM2-p53-SF1通路中，p53影響著小鼠卵母細(xì)胞的成熟和受精[20]。在人卵巢顆粒細(xì)胞中，p53通過MDM2-p53-SESN信號(hào)通路對(duì)下游基因SESN3進(jìn)行調(diào)節(jié)[21-22]。在本研究中，作為抗氧化基因，SESN3基因有差異表達(dá)，其是否可以通過調(diào)控卵母細(xì)胞氧化、衰老以及DNA損傷和修復(fù)過程影響受精結(jié)局，有待進(jìn)一步的證明。

卵母細(xì)胞未成熟或過熟會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)異常以及受精時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放異常。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是一種通用的聚合應(yīng)力，是產(chǎn)生細(xì)胞中心體、細(xì)胞核和紡錘體所必需的聚合應(yīng)力[23]，還參與細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂等過程[24-27]。GRLF1(ARHGAP35)基因可以抑制Rho活性，通過GRLF1-Rho-mDia信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合應(yīng)力纖維，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[27]。在本研究中，多精受精組中GRLF1基因的表達(dá)顯著上調(diào)。另外，過熟的卵母細(xì)胞在受精時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣釋放模式的改變以及肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的異常，導(dǎo)致多精受精率增高[28-29]。本研究也篩選出與鈣離子釋放相關(guān)的基因——TANC1基因顯著上調(diào)，TANC1是重要的突觸支架蛋白，在調(diào)節(jié)突觸棘密度和興奮性突觸強(qiáng)度中起關(guān)鍵作用，可能通過改變細(xì)胞內(nèi)鈣釋放模式以及肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)，影響受精結(jié)局。激素刺激不當(dāng)也會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)育異常導(dǎo)致多精受精，本研究篩選出的在多精受精組中表達(dá)上調(diào)的IGRBP5基因是促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的敏感基因，受卵泡刺激素的影響。

本研究最初設(shè)計(jì)時(shí)為防止各組中取樣細(xì)胞過少導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)偏差，故將同一個(gè)體的相同受精類型卵母細(xì)胞對(duì)應(yīng)的顆粒細(xì)胞進(jìn)行合并，篩選差異基因表達(dá)情況，這可能會(huì)使測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性存在偏差。下一步研究將對(duì)單精受精、0PN晚卵裂、多精受精每個(gè)卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，分析各種異常受精情況的差異基因表達(dá)情況。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，多精受精組與正常受精組比較顆粒細(xì)胞存在基因表達(dá)差異，其中，顯著上調(diào)的基因集中在與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟及凋亡、激素分泌、免疫、腫瘤發(fā)生、有絲分裂及受精過程相關(guān)的通路上，主要涉及p53信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控信號(hào)通路、HIPPO信號(hào)通路；顯著下調(diào)的基因則主要集中在細(xì)胞物質(zhì)代謝及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程。本研究通過對(duì)差異基因表達(dá)進(jìn)行分析，這可能為后續(xù)開展生殖過程中異常受精發(fā)生的影響因素研究提供一定的參考。