傳統(tǒng)針刺療法對波塞冬第三分組POR患者IVF-ET輔助治療效果及細(xì)胞因子的影響：隨機(jī)對照研究

楊婷，茍文婕，王薇，趙翠，陳學(xué)良，馬曉玲，王雅琦，張學(xué)紅

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)能夠解決大多數(shù)不孕癥患者的生育問題，然而仍有20%的不孕癥患者在IVF-ET治療中表現(xiàn)出對促性腺激素(Gn)刺激反應(yīng)不良，獲卵數(shù)少、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率低，被稱為卵巢低反應(yīng)(POR)[1]。近年來，文獻(xiàn)報道POR患者的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升且年輕化的趨勢，其IVF-ET臨床妊娠率僅為11.5%，周期取消率為34.4%[2]。如何提高POR患者輔助生殖助孕活產(chǎn)率，解決生育力低下問題，逐漸受到生殖醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

傳統(tǒng)針刺療法是一種安全綠色療法，在輔助生殖領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前關(guān)于其提高IVF-ET臨床妊娠率的作用尚存在爭議[2]。本課題采用波塞冬POR分類標(biāo)準(zhǔn)，選取滿足第3分組標(biāo)準(zhǔn)[3]的患者，即年齡<35歲、抗苗勒管激素(AMH)<1.2 ng/ml、基礎(chǔ)竇卵泡計數(shù)(AFC)<5個。目的在于綜合考量POR患者的年齡、卵巢儲備及反應(yīng)性，減少研究中的人群異質(zhì)性，規(guī)避年齡對活產(chǎn)率的直接影響，期望更精確探究傳統(tǒng)針刺治療對POR患者卵子質(zhì)量、妊娠結(jié)局及卵泡液中相關(guān)因子的表達(dá)，以及對于顆粒細(xì)胞線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)的影響。

資料與方法

一、研究對象及分組

選取2017年10月至2020年10月年因不孕癥在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的POR患者為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<35歲；符合POR波塞冬標(biāo)準(zhǔn)第3分組診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；因女性輸卵管因素行輔助生殖治療患者；促排卵方案采用改良微刺激方案。

排除標(biāo)準(zhǔn)：因放、化療或藥物使用等引起的POR；處于嚴(yán)重內(nèi)科疾病急性期；近期(3個月內(nèi))服用中藥、使用理療或者艾灸者；合并嚴(yán)重子宮畸形、宮腔粘連、腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥者；合并男性因素不孕者；夫婦因染色體異常行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)助孕者；改良微刺激方案當(dāng)月移植者。

根據(jù)臨床試驗(yàn)最低樣本量30例，考慮允許脫落率為20%，通過SPSS 20.0計算樣本總病例數(shù)為109例。采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，由SPSS 20.0軟件自動生成隨機(jī)數(shù)字，將不同的數(shù)字卡片放在紙袋中密封。根據(jù)患者就診順序，隨機(jī)抽取信封，其中抽取的數(shù)字卡片為單數(shù)者納入針刺治療組(針刺組)共50人，抽取的數(shù)字卡片為雙數(shù)者納入空白對照組(對照組)共59人。

剔除標(biāo)準(zhǔn)：受試者依從性差，不能堅持研究治療方案者；治療中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)及嚴(yán)重并發(fā)癥，或促排卵過程中因低反應(yīng)取消取卵者；因其他原因自行要求退出者。

本研究方案經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：LDYYLL2020-164)，所有研究對象均充分知情同意后簽署知情同意書。

二、治療方案

1.針刺治療：采用房繄恭教授的“房氏調(diào)經(jīng)促孕十三針”方案，選取關(guān)元、大赫(雙)、氣海、腎俞(雙)、中極、足三里(雙)、三陰交(雙)、太沖(雙)、太溪(雙)穴[4]。具體實(shí)施中，關(guān)元、大赫(雙)、氣海、腎俞(雙)、足三里(雙)各穴直刺1～1.5寸；中極、三陰交(雙)、太沖(雙)、太溪(雙)各穴直刺0.5～1寸。腧穴要求得氣，留針期間每隔10 min平補(bǔ)平瀉法行針1次，共留針30 min。于促排卵前連續(xù)2個月于患者早卵泡期開始每日針刺1次，共10 d；促排卵期間從促排卵第1天開始針刺10 d，共計3個周期。針刺治療由同一位副主任針灸醫(yī)師獨(dú)立完成。對照組不進(jìn)行針刺治療。

2.IVF-ET治療：患者均采用改良微刺激促排卵方案。在月經(jīng)第2天予來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥)2.5 mg/d共5 d，同時給予尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠醫(yī)藥)150～300 U/d，根據(jù)卵泡生長情況及激素水平適時調(diào)整藥物用量。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑大于18 mm時扳機(jī)，注射重組HCG(默克雪蘭諾，德國)250 μg，34～36 h后取卵，常規(guī)行IVF。獲得優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍保存，擇期行凍融胚胎移植(FET)。

3.FET：FET周期均采用人工周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜?；颊咴陆?jīng)周期第3～5天予戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國)4～6 mg/d共14～18 d，經(jīng)陰道超聲監(jiān)測內(nèi)膜厚度≥8 mm時予口服地屈孕酮(雅培，荷蘭)30 mg/d和陰道放置黃體酮軟膠囊(益普生，法國)600 mg/d行黃體轉(zhuǎn)化3 d，選擇凍融復(fù)蘇的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進(jìn)行移植，移植術(shù)后持續(xù)黃體支持至驗(yàn)孕日。

4.妊娠判定：移植后兩周檢測血HCG陽性(HCG≥5 U/L)但B超未見孕囊者為生化妊娠；移植后4周陰道超聲觀察到宮內(nèi)妊娠囊及胎心搏動為臨床妊娠；患者孕28周以上胎兒出生有生命跡象為活產(chǎn)。

三、實(shí)驗(yàn)操作

1.卵泡液及顆粒細(xì)胞收集：患者取卵術(shù)后，保留直徑≥18 mm成熟卵泡的清亮卵泡液，常溫下2 000 r/min離心，取上清液-80℃冰箱保存待檢；取沉淀置于2 ml 50% Percoll液中，4 000 r/min離心10 min，去除血細(xì)胞，吸出兩層界面處的顆粒細(xì)胞，重復(fù)加入2 ml 50% Percoll液，吸出漂浮絮狀顆粒細(xì)胞，PBS清洗2次，-80℃冰箱保存待測。

2.卵泡液細(xì)胞因子檢測：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物)測量卵泡液β-內(nèi)啡肽(β-EP)、間隙連接蛋白43(Cx43)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)水平。實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫分析，用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)過洗滌之后再加入待測樣品(含抗原)，經(jīng)過保溫孵育洗滌等一系列操作后，進(jìn)行顯色之后測定，測定出欲測抗原(底物)的量。

3.顆粒細(xì)胞DNA提取及mtDNA拷貝數(shù)定量檢測：采用柱式法DNA抽提試劑盒(上海生工)抽提DNA，通過實(shí)時定量PCR(Real time-PCR)方法，選取高度保守序列ND1(mtDNA管家基因)作為目的基因，HGB基因作為內(nèi)參，通過相對定量方法計算mtDNA拷貝數(shù)。ND1基因引物：上游5′-CCCTAAAACCCGCCACATCT-3′，下游5′-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3′；HGB基因引物：上游5′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3′，下游5′-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3′。MT-ND1擴(kuò)增條件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)；HGB的擴(kuò)增條件是：95℃ 10 min，95℃ 15 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。采用實(shí)時定量PCR分別得到兩組的顆粒細(xì)胞中目的基因ND1和HGB的CT值，通過2-ΔΔCT的計算方法得到相對表達(dá)量。

四、觀察指標(biāo)

研究對象的一般資料，包括年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AFC、AMH水平；促排卵指標(biāo)，包括促排卵天數(shù)、促排卵用藥總量、獲卵數(shù)、卵泡輸出率[HCG日成熟卵泡數(shù)(直徑16～22 mm卵泡)/基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(直徑3～8 mm卵泡)×100%]、MⅡ卵率(MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)/總獲卵數(shù)×100%)；受精及胚胎培養(yǎng)/移植結(jié)局，包括2PN數(shù)、2PN受精率(2PN數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞總數(shù)×100%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN數(shù)×100%)及累計活產(chǎn)率(獲得活產(chǎn)的患者數(shù)/一次取卵周期患者數(shù)×100%)等。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者助孕資料

本研究共納入109例POR波塞冬第3分組患者，隨機(jī)分為針刺組(50人)和對照組(59人)兩組。兩組患者均無中途脫落，無失訪病例，無不良反應(yīng)發(fā)生病例。

1.患者基礎(chǔ)資料：兩組患者間年齡、不孕年限、BMI、AMH、AFC比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較(-±s)

2.患者助孕過程及結(jié)局資料：針刺組MⅡ卵率顯著高于對照組(P<0.05)；兩組患者間其他促排卵、胚胎發(fā)育指標(biāo)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；兩組間解凍移植日內(nèi)膜厚度及累計活產(chǎn)率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

二、卵泡液中卵子發(fā)育相關(guān)因子和炎癥因子表達(dá)

針刺組患者卵泡液中ICAM-1及COX-2濃度均顯著低于對照組(P<0.05)，而兩組間卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4濃度比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者助孕過程及結(jié)局資料比較[(-±s)，%]

表3 兩組患者卵泡液細(xì)胞因子濃度比較(-±s)

三、顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)

本研究采用實(shí)時定量PCR分別得到兩組患者顆粒細(xì)胞中mtDNA管家基因ND1和HGB的CT值，通過2-ΔΔCT計算相對表達(dá)量。經(jīng)t檢驗(yàn)，針刺組和對照組ND1和HGB的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.835)，提示兩組間線粒體基因拷貝數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組患者顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)比較(-±s)

四、安全性評價

針刺組與對照組患者治療前后檢測血、尿常規(guī)及肝腎功能和心電圖均未見明顯異常，均未出現(xiàn)卵巢過度刺激綜合征(OHSS)及取卵后出血等不良事件。

討 論

目前POR患者發(fā)病率逐年上升且年輕化，該類患者IVF-ET妊娠率仍不理想。文獻(xiàn)報道給予POR患者300 U促性腺激素(Gn)啟動劑量，IVF促排卵周期活產(chǎn)率僅為11%[5]。有研究表明導(dǎo)致POR的危險因素包括年齡、遺傳、免疫、環(huán)境、卵巢手術(shù)、放化療等[6]，提高POR患者IVF-ET臨床妊娠率的關(guān)鍵靶點(diǎn)在于提高IVF-ET治療中的卵泡輸出率及胚胎質(zhì)量，以下措施目前較為常用：優(yōu)化促排卵方案，添加生長激素、脫氫表雄酮(DHEA)、抗氧化劑等，卵母細(xì)胞線粒體移植技術(shù)，傳統(tǒng)中藥及針灸療法等[7]。本研究旨在探討傳統(tǒng)針刺治療對于POR患者IVF-ET治療中胚胎質(zhì)量及卵泡發(fā)育相關(guān)因子表達(dá)的影響。

一、傳統(tǒng)針刺治療對IVF累計妊娠率及活產(chǎn)率的影響

近年來國內(nèi)外發(fā)表的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)及系統(tǒng)評價對于針刺療法是否能改善IVF妊娠結(jié)局尚存在爭議。多項(xiàng)研究表明針刺治療可以提高IVF-ET患者的臨床妊娠率[8-9]；而2017年美國生殖醫(yī)學(xué)會(ASRM)指南中指出輔助針刺治療不能改善妊娠結(jié)局[10]；Smith等[11]研究顯示，針刺不能提高接受IVF-ET治療患者的活產(chǎn)率，但國內(nèi)王亞楠等[12]指出Smith等[11]的研究所選取的患者群體、針刺選穴、刺激量及介入時機(jī)，以及患者自身狀況不同造成研究結(jié)果異質(zhì)性大。另有研究表明，在IVF-ET治療中輔助傳統(tǒng)針刺及激光針刺療法能夠緩解患者緊張，改善患者心理壓力等情緒問題[13]。

本研究中針刺組與對照組患者累計活產(chǎn)率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，分析原因可能與選取人群有關(guān)。有研究表明年齡是預(yù)測圍產(chǎn)期結(jié)局和累計活產(chǎn)率的關(guān)鍵參數(shù)[8]，本研究中選取波塞冬第3分組的POR患者，年齡<35歲，排除子宮畸形及男方因素性不孕，前期均募集到優(yōu)質(zhì)胚胎，所以兩組累計活產(chǎn)率均能達(dá)到50%左右。本研究中傳統(tǒng)針刺治療3個周期并不能提高波塞冬第3分組POR患者的累計活產(chǎn)率，但因本研究樣本量較少，針刺治療是否能提高IVF-ET患者的累計活產(chǎn)率仍需要多中心、同質(zhì)化的大樣本臨床研究來驗(yàn)證。

二、傳統(tǒng)針刺治療對POR患者的作用

本研究結(jié)果表明針刺組較對照組POR患者M(jìn)Ⅱ卵率顯著提高(P<0.05)。Haahr等[7]指出，針對波塞冬第3分組的年輕POR人群，IVF-ET的困難在于如何提高卵泡輸出率和募集優(yōu)質(zhì)胚胎。李曉彤等[14]指出針刺對于卵巢儲備功能低下(DOR)的患者有一定的治療作用，其研究發(fā)現(xiàn)針刺調(diào)經(jīng)促孕治療可以改善DOR患者的卵巢儲備功能，且安全性較好。本研究中兩組POR患者獲卵數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，卵泡輸出率均達(dá)到80%以上，受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但針刺組MⅡ卵率顯著提高(P<0.05)，平均優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)略高于對照組，雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但對于AFC<5個的POR患者來說，多1個可用優(yōu)質(zhì)胚胎可相對增加POR患者移植機(jī)會。

三、傳統(tǒng)針刺輔助治療后卵泡液細(xì)胞因子指標(biāo)變化

在本研究中，兩組患者卵泡液中β-EP、Cx43、BMP-4表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。卵泡液為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供了非常重要的微環(huán)境，卵泡液相關(guān)生化指標(biāo)可以反映卵子成熟度及后期胚胎發(fā)育潛能[15]。Tam等[16]發(fā)現(xiàn)β-EP水平在IVF患者獲得形態(tài)成熟卵母細(xì)胞的卵泡液中較未成熟卵母細(xì)胞卵泡液中含量低，認(rèn)為卵巢局部分泌β-EP，卵泡液中少量的β-EP與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能有關(guān)。本研究中針刺組與對照組卵泡液β-EP濃度未見明顯差異，提示針刺治療可能并不影響卵巢局部分泌β-EP。BMP-4為轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)超家族一員，是卵泡生長發(fā)育過程中的促進(jìn)因子，參與卵巢內(nèi)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其能促進(jìn)始基卵泡向竇前卵泡轉(zhuǎn)化和生長[17]。Cx43表達(dá)于顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間，進(jìn)行新陳代謝物質(zhì)傳遞及雙向信息交流，在卵泡選擇過程中發(fā)揮重要作用[18]。本研究中兩組患者卵泡液中Cx43、BMP-4表達(dá)均無明顯差異，由此我們推測傳統(tǒng)針刺治療在卵泡早期募集階段可能發(fā)揮作用不大。

本研究中，針刺組患者卵泡液中ICAM-1、COX-2水平較對照組顯著降低(P<0.05)。ICAM-1被稱為CD54，在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中少量表達(dá)，在白介素-1(IL-1)等作用下在多種類型的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[19]。COX-2是一種環(huán)氧酶同工酶；細(xì)胞受到刺激后，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)其表達(dá)，催化前列腺素合成，參與炎癥反應(yīng)[20]。有研究表明在卵巢干細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，炎性因子可能干擾其正常功能并引起卵巢干細(xì)胞凋亡[21]。本研究中針刺治療能夠降低卵泡液中ICAM-1、COX-2分泌水平，一定程度上抑制了IVF-ET促排卵治療中的過度炎癥反應(yīng)，對于卵子發(fā)育具有正性作用。

四、傳統(tǒng)針刺輔助治療后顆粒細(xì)胞mtDNA表達(dá)變化

顆粒細(xì)胞是組成卵冠丘復(fù)合物的主要細(xì)胞成分，為卵母細(xì)胞提供ATP合成底物、相關(guān)類固醇激素及生長因子，保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[22]。顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)可以直接反應(yīng)線粒體生物學(xué)功能，與胚胎質(zhì)量密切相關(guān)。有研究表明優(yōu)質(zhì)胚胎較劣質(zhì)胚胎mtDNA拷貝數(shù)明顯增高[23]。本研究中，兩組患者間顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，針刺組略有增高的趨勢，這與針刺組的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)略高于對照組的趨勢一致，但考慮到本研究樣本量有限，后續(xù)還需要大樣本研究進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

五、POR患者輔助傳統(tǒng)針刺治療的中醫(yī)辨證學(xué)分析

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主生殖，司開合，為生殖之本。POR不孕癥患者歸屬為“不孕”“閉經(jīng)”“血枯”等范疇，發(fā)病大多與肝郁脾虛、腎精不固、天癸、沖任和子宮功能失調(diào)，臟腑氣血虧虛，沖任不能相資，影響胞脈胞絡(luò)的功能[4]。

POR患者在促排卵階段表現(xiàn)為腎陽匱虛、脾失健運(yùn)，肝氣郁滯、氣滯血瘀，氣血失衡[14]。中國中醫(yī)科學(xué)院針灸醫(yī)院房繄恭教授根據(jù)患者發(fā)病特點(diǎn)，選取疏肝解郁、滋補(bǔ)脾腎、調(diào)理沖任氣血的穴位，配合恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)瀉手法形成“房式十三針”方案[4]。本研究遵循“房式十三針”經(jīng)典選穴方案，主要選穴任沖二脈，足三陰經(jīng)及膀胱經(jīng)的穴位；常用腧穴是以任脈的中極、關(guān)元、氣海，針之可固腎益精、調(diào)節(jié)沖任；胃經(jīng)的足三里，針之可健脾和胃、扶助正氣；脾經(jīng)的三陰交，針之可健脾益腎、通絡(luò)調(diào)經(jīng)、補(bǔ)血活血；膀胱經(jīng)的腎俞，針之可有效刺激盆腔神經(jīng)，影響盆腔內(nèi)生殖活動；腎經(jīng)的大赫，肝經(jīng)的太沖等為常用首選要穴。以上諸穴相互配伍，攻補(bǔ)兼施。

綜上，在輔助生殖治療中輔助針刺治療由來已久，針刺療法做為一種安全綠色的補(bǔ)充治療方法，具有多層次、多水平、多靶點(diǎn)的綜合治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，波塞冬POR第3分組患者IVF-ET治療中輔助3個周期傳統(tǒng)針刺治療能夠提高M(jìn)Ⅱ卵率，降低卵泡液中炎性因子ICAM-1、COX-2的分泌，但對于妊娠結(jié)局的影響不大。提示傳統(tǒng)針刺療法可能通過降低卵泡液中炎性因子水平發(fā)揮改善卵子質(zhì)量的作用，但需要更進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。