宮腔灌注對(duì)胚胎反復(fù)種植失敗患者在凍融胚胎移植周期中的影響

程立立，劉少華，劉珊，許鵬宇，李冬秀，劉秀萍，劉松娜，齊麗麗

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050000；2.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院，邢臺(tái) 054000；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八○醫(yī)院，石家莊 050000)

目前，關(guān)于胚胎反復(fù)種植失敗(RIF)并沒有一個(gè)普遍接受的定義，較公認(rèn)的定義為：經(jīng)歷3次及以上移植周期，且累積移植卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目不少于4枚或高評(píng)分囊胚2枚而未獲得臨床妊娠者[1]。胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是成功著床的兩個(gè)重要因素[2]。對(duì)于RIF患者而言，最主要的影響因素是子宮內(nèi)膜容受性。因此，改善子宮內(nèi)膜容受性對(duì)于改善RIF患者的妊娠結(jié)局具有重要意義，是輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。宮腔灌注是目前臨床上改善子宮內(nèi)膜容受性的常用方法，灌注藥物多種多樣，包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及地塞米松磷酸鈉注射液(DexSPI)等，對(duì)子宮內(nèi)膜厚度、胚胎種植率及臨床妊娠率均有明顯提高。但是關(guān)于不同的灌注物之間是否存在治療差異鮮有研究。本研究擬探討宮腔灌注G-CSF、DexSPI和HCG對(duì)子宮內(nèi)膜和妊娠結(jié)局的影響，以期找到有效的改善子宮內(nèi)膜容受性的方法，提高胚胎著床率及臨床妊娠率。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2018年5月至2021年10月于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八○醫(yī)院生殖中心接受凍融胚胎移植(FET)治療并行宮腔灌注的120例RIF患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)本周期采用激素替代方案準(zhǔn)備內(nèi)膜；(2)本次移植至少有1枚優(yōu)質(zhì)卵裂胚。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥38歲；(2)宮腔灌注前內(nèi)膜厚度<7 mm；(3)存在其他影響胚胎著床的因素，如子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管積水以及宮腔粘連等；(4)存在某些其他的合并癥，如凝血功能異常，免疫系統(tǒng)異常等。

根據(jù)宮腔灌注藥物不同分為3組：宮腔灌注HCG的HCG組(44例)，宮腔灌注G-CSF的G-CSF組(42例)，宮腔灌注G-CSF+DexSPI的G-CSF+DexSPI組(34例)。選擇同期行激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜、僅行FET(未行宮腔灌注)的36例患者為對(duì)照組。

二、研究方法

1.內(nèi)膜準(zhǔn)備：采用激素替代方案準(zhǔn)備內(nèi)膜?；颊哂谠陆?jīng)第2～3天開始口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國(guó))6～8 mg/d，7 d后返院。根據(jù)內(nèi)膜厚度及血清激素水平調(diào)整補(bǔ)佳樂劑量，于用藥的16～18 d、子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm、E2>734 pmol/L時(shí)，給予雪諾酮(默克雪蘭諾，德國(guó))90 mg/d+地屈孕酮(雅培，荷蘭)20 mg/d或者安琪坦(法杏大藥廠，法國(guó))400 mg/d+地屈孕酮20 mg/d轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜，4 d后移植解凍復(fù)蘇的卵裂胚。

2.宮腔灌注液的配制：(1)HCG組：用2 ml的生理鹽水溶解2 000 U的HCG(珠海麗珠)，混合均勻后抽取0.5 ml的液體，即500 U的HCG備用；(2)G-CSF組：將G-CSF(吉賽欣，石家莊華北制藥)150 μg(0.6 ml)抽吸入1 ml的注射器內(nèi)備用；(3)G-CSF+DexSPI組：將G-CSF 75 μg(0.3 ml)和DexSPI(地塞米松磷酸鈉注射液，天津金耀)5 mg(1 ml)抽吸入2 ml的注射器內(nèi)備用。

3.宮腔灌注的方法：于子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日(移植前4 d)行宮腔內(nèi)灌注，囑患者排空膀胱，取膀胱截石位。常規(guī)消毒外陰，鋪無菌洞巾，窺器暴露宮頸，生理鹽水棉球擦拭陰道和宮頸。用注射器吸取灌注液，與一次性無菌人工授精管相連接，將人工授精管置入宮腔，緩慢將藥液注入宮腔，停留數(shù)秒后取出人工授精管。囑患者臥床休息30 min。

4.卵裂胚質(zhì)量的評(píng)估：根據(jù)卵裂球數(shù)目[第3日(D3)胚胎的卵裂球數(shù)目≥6細(xì)胞]、形態(tài)和胞漿中的碎片等將胚胎分為4級(jí)[3]。Ⅰ級(jí)：胚胎卵裂球形態(tài)規(guī)則，大小均勻，透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，碎片無或少于5%；Ⅱ級(jí)：胚胎卵裂球形態(tài)略不規(guī)則，大小略不均，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片10%～20%；Ⅲ級(jí)：胚胎卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片21%～50%；Ⅳ級(jí)：胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片大于50%。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，本研究?jī)?yōu)質(zhì)胚胎評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：取卵后D3胚胎評(píng)分為Ⅰ、Ⅱ級(jí)，7個(gè)≤卵裂球≤9個(gè)、排列規(guī)則、碎片≤20%的胚胎。

5.黃體支持與隨訪：所有胚胎均采用玻璃化冷凍，復(fù)蘇后選擇至少1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，給予常規(guī)黃體支持(雪諾酮90 mg/d或者安琪坦400 mg/d+地屈孕酮20 mg/d)，移植后14 d查血β-HCG，若β-HCG>50 U/L為陽(yáng)性；陽(yáng)性者移植后30 d行B超檢查，觀察到妊娠囊或胎心搏動(dòng)為臨床妊娠，隨訪至胚胎移植后70 d。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組一般情況比較

4組患者間平均年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)、基礎(chǔ)黃體生成素(bLH)及基礎(chǔ)雌二醇(bE2)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況比較(-±s)

二、各組胚胎移植和內(nèi)膜情況比較

4組患者間既往移植失敗周期數(shù)及移植失敗周期優(yōu)胚數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本次移植胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度及胚胎移植日內(nèi)膜厚度之間均無顯著差異性(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者胚胎移植和內(nèi)膜情況比較(-±s)

三、各組妊娠結(jié)局比較

HCG組、G-CSF組及G-CSF+DexSPI組患者本周期的胚胎著床率、臨床妊娠率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而3組患者間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。4組患者間早期流產(chǎn)率、異位妊娠率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者妊娠結(jié)局比(%)

討 論

目前，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成為不孕患者成功妊娠的主要手段。隨著控制性卵巢刺激(COS)方案的不斷完善、胚胎實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及技術(shù)的不斷提高，IVF/ICSI周期的胚胎著床率、臨床妊娠率均得到了顯著提高，但仍有部分患者出現(xiàn)RIF。對(duì)于RIF患者來說，子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎著床的重要因素之一[4]。

子宮內(nèi)膜容受性又稱著床窗口期，是子宮內(nèi)膜接納容受胚胎的一種能力，是允許胚胎黏附、穿透并侵入的一種狀態(tài)[5-6]，其機(jī)制復(fù)雜。目前，對(duì)于子宮內(nèi)膜容受性的研究較多，有藥物治療、子宮內(nèi)膜搔刮及宮腔灌注等[7-10]。其中宮腔灌注是近年來出現(xiàn)的一種新型治療方法，是將某些藥物或細(xì)胞因子于特定時(shí)期經(jīng)宮頸內(nèi)口緩慢注入宮腔內(nèi)以改善內(nèi)膜狀況的一種方法，是相對(duì)無創(chuàng)的一種治療方法。一般是在胚胎移植前1～3 d進(jìn)行灌注，也有的研究于移植前1～2 h進(jìn)行灌注。灌注的藥物主要有G-CSF、HCG、生長(zhǎng)激素(GH)、DexSPI、自體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)等。

在子宮內(nèi)膜種植窗期，有多種細(xì)胞及體液因子的參與，其中HCG的作用至關(guān)重要[11]。HCG是胚胎種植前分泌的一種早期信號(hào)分子，可以啟動(dòng)、控制胎盤絨毛膜細(xì)胞侵襲、種植，在胚胎著床、妊娠中發(fā)揮著重要的作用。有研究報(bào)道，宮腔內(nèi)灌注HCG可上調(diào)胚胎植入的相關(guān)蛋白，有利于胚胎種植，顯著提高臨床妊娠率[12]。

Gao等[13]的一篇納入15項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)的Meta分析研究結(jié)果表明，移植前宮腔灌注HCG，不但能提高胚胎種植率、臨床妊娠率及胎兒出生率，還能降低流產(chǎn)率。張樂等[14]的一項(xiàng)Meta分析也表明，灌注組與對(duì)照組相比，胚胎種植率與臨床妊娠率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但也有研究結(jié)果顯示，行FET前宮腔內(nèi)灌注500 U HCG并不明顯提高妊娠率[15]。

在生殖系統(tǒng)中，G-CSF由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，參與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、排卵以及妊娠等多個(gè)環(huán)節(jié)。宮腔灌注G-CSF，可以使內(nèi)膜組織血流信號(hào)增加，刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增生，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的修復(fù)與生長(zhǎng)，促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞因子的分泌，改善子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎種植率增加；宮腔灌注G-CSF，還可抑制子宮內(nèi)膜炎癥。張曦倩等[16]研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者于移植前宮腔灌注G-CSF，通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部輔助T淋巴細(xì)胞，使Th1/Th2與Th17/Treg達(dá)到平衡，從而提高胚胎種植率和臨床妊娠率。甘永安等[17]的一項(xiàng)納入宮腔灌注G-CSF的840個(gè)周期的Meta分析表明，宮腔灌注G-CSF患者的胚胎種植率、臨床妊娠率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組間排卵日子宮內(nèi)膜厚度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。白春梅等[18]的研究結(jié)果表明，宮腔灌注G-CSF能增加薄型子宮內(nèi)膜患者FET周期中子宮內(nèi)膜厚度、胚胎種植率和臨床妊娠率，降低周期取消率。而Lian等[19]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于RIF患者，宮腔灌注G-CSF雖然可增加子宮內(nèi)膜厚度，但患者的胚胎種植率無明顯增加。另一項(xiàng)研究也表明，對(duì)于子宮內(nèi)膜厚度正常的RIF患者，宮腔灌注G-CSF不能增加患者的子宮內(nèi)膜厚度及胚胎種植率[20]。

本研究選取子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行宮腔灌注的RIF患者作為研究對(duì)象進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，宮腔灌注HCG及G-CSF不增加子宮內(nèi)膜厚度，但可以改善子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎著床率和臨床妊娠率顯著增高(P<0.05)，同時(shí)不增加流產(chǎn)率及異位妊娠率，與之前大多數(shù)學(xué)者們的研究結(jié)果相一致。

地塞米松是一種糖皮質(zhì)激素，作用于T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞，抑制炎性因子的分泌及聚集[21-22]，同時(shí)抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性，起到免疫調(diào)節(jié)作用。地塞米松廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病和移植后的排斥反應(yīng)。Zhang等[23]研究指出，RIF與子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK)有關(guān)，對(duì)于宮腔內(nèi)高uNK導(dǎo)致RIF的患者，宮腔灌注地塞米松能夠下調(diào)uNK的比例，從而改善子宮內(nèi)膜的容受性，提高妊娠率。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，宮腔灌注地塞米松用于uNK細(xì)胞比例異常的RIF患者，可以明顯改善妊娠結(jié)局；對(duì)于宮腔鏡檢查提示有慢性子宮內(nèi)膜炎的RIF患者，宮腔灌注抗生素+地塞米松的治療較單純灌注抗生素效果顯著，認(rèn)為地塞米松能改善宮腔內(nèi)局部免疫環(huán)境[24-25]。

本研究選取單純行G-CSF灌注及G-CSF+DexSPI灌注的患者進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，F(xiàn)ET前內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行宮腔灌注G-CSF+DexSPI患者的胚胎著床率及臨床妊娠率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；胚胎著床率及臨床妊娠率稍高于G-CSF組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與之前學(xué)者用地塞米松對(duì)子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞異常及慢性子宮內(nèi)膜炎的RIF患者治療效果一致。

本研究對(duì)不同的灌注藥物對(duì)妊娠結(jié)局的影響進(jìn)行比較，且入組患者全部采用激素替代方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備，排除了方案不同對(duì)妊娠率的影響，使結(jié)果更加可靠。本研究在實(shí)驗(yàn)組間也進(jìn)行了比較，HCG組、G-CSF組及G-CSF+DexSPI組3組間的胚胎著床率、臨床妊娠率及早期流產(chǎn)率、異位妊娠率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。提示對(duì)于RIF患者來說，這3種宮腔灌注方案均可選擇，可提高胚胎著床率及臨床妊娠率。

綜上所述，對(duì)于RIF患者，通過宮腔灌注HCG、G-CSF或G-CSF+DexSPI可以改善子宮內(nèi)膜容受性，提高胚胎著床率及臨床妊娠率；且宮腔灌注通過局部給藥，可使藥物在局部達(dá)到更高的濃度，全身不良反應(yīng)小，花費(fèi)低，效果好。因此，臨床可根據(jù)RIF患者具體情況，在這3種灌注方案中選擇合適的灌注方法，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率。