供精常規(guī)體外受精過程中多精受精的發(fā)生對(duì)生殖結(jié)局的影響

趙小利，薛俠，師娟子，李明昭

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003)

目前，已報(bào)道的影響多精受精發(fā)生的因素很多，且仍存在爭議。有研究分析了1984—2019年中國有生育力男性精子濃度的變化，數(shù)據(jù)顯示我國男性精子濃度呈下降趨勢(shì)[3]。鑒于男性精液質(zhì)量的逐年下降，需尋求供精治療的IVF周期越來越多，通常占所有IVF周期的1%～3%[4]。本研究選取供精I(xiàn)VF(IVF-D)治療的患者作為研究對(duì)象，以盡可能降低精子因素對(duì)多精受精發(fā)生的影響，旨在探討多精受精的發(fā)生是否影響IVF-D周期其它正常受精胚胎的發(fā)育和臨床結(jié)局。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年1月至2020年12月于我院行IVF-D治療患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤38歲；(2)女方血清基礎(chǔ)FSH(bFSH)<10 U/L；(3)第1次新鮮周期供精常規(guī)IVF-ET。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮內(nèi)膜異位癥；(2)卵巢功能衰退；(3)子宮畸形及宮腔病變；(4)輸卵管積水；(5)多囊卵巢綜合征。

共納入1 526例患者。根據(jù)多精受精(≥3PN)率不同分為3組：多精受精率為0%的為對(duì)照組(n=854)，0%<多精受精率≤20%的為低頻多精組(n=483)，多精受精率>20%的為高頻多精組(n=189)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)：所有患者均采用COH，根據(jù)患者具體情況選擇合適的COH方案，具體細(xì)節(jié)參考已報(bào)道文獻(xiàn)[5]。

2.精液處理及常規(guī)授精：將精液凍存管放入37℃水浴10 min，精液復(fù)蘇后精子活動(dòng)率>40%，采用密度梯度離心法與上游法相結(jié)合的方法獲得活動(dòng)精子。具體操作流程如下：密度梯度離心采用40%及80%上下層梯度離心液(Cooper Surgical，美國)，洗滌液和上游液分別為精子洗滌液(Spermrinse，Vitrolife，瑞典)和受精液(G-IVF plus，Vitrolife，瑞典)。采用四孔板進(jìn)行授精，每孔加入0.6 ml預(yù)平衡好的受精液，通過精子計(jì)數(shù)每孔加入1.0×105條精子，每孔放置2～3枚卵母細(xì)胞，精卵共同孵育，5 h后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無精子的受精液中去除顆粒細(xì)胞。

3.受精觀察：受精5 h后脫顆粒觀察第二極體，如果1/3的成熟卵可見明顯第二極體，直接放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，18 h后再次觀察，有2個(gè)原核(2PN)判定為正常受精，3個(gè)及以上者(≥3PN)判定為多精受精。

4.胚胎培養(yǎng)及移植策略：受精卵繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察胚胎發(fā)育情況，選擇第3天(D3)卵裂期胚胎移植，或培養(yǎng)至D5進(jìn)行囊胚移植。根據(jù)D3胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)，對(duì)于有≥2個(gè)以上優(yōu)質(zhì)卵裂胚的患者在充分知情同意后繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)至D5，有優(yōu)質(zhì)囊胚者行單囊胚移植，無優(yōu)質(zhì)囊胚者行雙囊胚移植。胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考已報(bào)道的評(píng)分方法[6]。

為研究表活劑擴(kuò)散彌散對(duì)開發(fā)效果的影響，保證模型中其他參數(shù)設(shè)置不變，通過改變表面活性劑濃度來改變毛細(xì)管力，使其分別原始毛細(xì)管力的0.5倍、0.66倍、1倍、1.5倍、2倍，對(duì)比不同聚合物吸附濃度的開發(fā)效果，模擬結(jié)果見表3。

5.妊娠判斷：移植后6周B超見孕囊者為臨床妊娠，移植后12周B超見胎心者為持續(xù)妊娠。妊娠不足28周、胎兒體重小于1 kg而終止妊娠者為流產(chǎn)。胎兒出生后具有呼吸、心跳、臍帶搏動(dòng)、隨意肌收縮4種生命現(xiàn)象之一者為活產(chǎn)。

6.觀察指標(biāo)：主要觀察指標(biāo)為正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚胎率、囊胚形成率、種植率、臨床妊娠率、多胎率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率。正常受精率=正常受精卵母細(xì)胞數(shù)/獲卵總數(shù)×100%，卵裂率=受精卵裂胚胎數(shù)/受精卵數(shù)×100%，優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%，可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%，囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%，種植率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，多胎率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，異位妊娠率=發(fā)生異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)嬰兒周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組基本資料比較

本研究共納入1 526例患者，共1 526個(gè)IVF-D周期，其中多精受精率0%的占比為55.96%(854/1 526)，0%<多精受精率≤20%的占比為31.65%(483/1 526)，多精受精率>20%的占比為12.39%(189/1 526)。

各組間年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、bFSH及促性腺激素(Gn)天數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)；對(duì)照組的獲卵數(shù)顯著低于低頻多精組[(9.51±4.43)枚vs.(12.39±3.86)枚，P<0.05](表1)。

表1 各組間患者基本資料比較(-±s)

二、各組胚胎發(fā)育情況比較

與高頻多精組比較，對(duì)照組和低頻多精組的正常受精率顯著升高(P<0.05)，而可用胚胎率顯著降低(P<0.05)；各組間卵裂率、優(yōu)胚率及囊胚形成率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組間胚胎發(fā)育情況比較(%)

三、各組胚胎移植情況及妊娠結(jié)局比較

各組間移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、單胚胎移植率和囊胚移植率比較均無顯著性差異(P>0.05)；對(duì)照組和低頻多精組的種植率、臨床妊娠率、多胎率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率均略高于高頻多精組，流產(chǎn)率和異位妊娠率略低于高頻多精組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組間胚胎移植情況及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

精卵受精的過程受到多重機(jī)制的調(diào)控，透明帶反應(yīng)和皮質(zhì)反應(yīng)這兩個(gè)重要機(jī)制確保了正常受精的發(fā)生。透明帶反應(yīng)是阻止多精受精發(fā)生的首要機(jī)制，透明帶硬化阻止正在穿透透明帶的精子繼續(xù)進(jìn)入卵母細(xì)胞；皮質(zhì)反應(yīng)是阻止多精受精發(fā)生的另一重要機(jī)制，卵母細(xì)胞釋放皮質(zhì)顆粒，切割透明帶中的精子結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致其他精子不能識(shí)別進(jìn)而與卵母細(xì)胞結(jié)合。近些年，又有一些新的多精受精防護(hù)機(jī)制相繼被報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，受精后卵母細(xì)胞質(zhì)膜上的部分精子受體蛋白迅速消失，使得其它精子不再與質(zhì)膜發(fā)生融合[7]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶2(Tgm2)在卵母細(xì)胞的皮層下大量積累，并于受精后發(fā)揮功能，已有研究證實(shí)Tgm2是一個(gè)新的阻止多精受精發(fā)生的分子[8]。

常規(guī)IVF過程中，多精受精的發(fā)生率仍有2%～10%[9]。導(dǎo)致多精受精發(fā)生的因素可能來自精子因素，也可能來自其它因素。早期有研究認(rèn)為，精子濃度增加可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒延遲釋放提高多精受精率[10]。但也有研究認(rèn)為，精子濃度增加不會(huì)提高多精受精率[11]。眾所周知，未成熟卵母細(xì)胞不能發(fā)生完善的皮質(zhì)反應(yīng)和透明帶反應(yīng)，導(dǎo)致多精受精率增加。過熟卵母細(xì)胞老化后，只能部分釋放或不能釋放皮質(zhì)顆粒，致使皮質(zhì)反應(yīng)不徹底或不能發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)，也會(huì)導(dǎo)致多精受精率增加。有研究發(fā)現(xiàn)，HCG日E2水平高和獲卵數(shù)多是導(dǎo)致多精受精發(fā)生的重要因素，低頻多精組的平均獲卵數(shù)顯著高于對(duì)照組[12]。本中心研究數(shù)據(jù)亦顯示，低頻多精組的平均獲卵數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。獲卵數(shù)多可能導(dǎo)致部分卵母細(xì)胞發(fā)育程度參差不齊，出現(xiàn)未熟和過熟卵母細(xì)胞幾率增加，進(jìn)而導(dǎo)致多精受精現(xiàn)象的發(fā)生。本中心采用短時(shí)受精和早剝離顆粒細(xì)胞的技術(shù)手段，目前關(guān)于此類操作是否影響多精受精的發(fā)生仍存在爭議[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)受精和早剝離顆粒細(xì)胞較過夜受精不會(huì)提高多精受精率[15]。

關(guān)于多精受精的發(fā)生是否影響IVF-ET患者的臨床結(jié)局一直存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，多精受精出現(xiàn)的周期臨床妊娠率高于無多精受精出現(xiàn)的周期[16-17]。也有研究認(rèn)為，多精受精的發(fā)生不會(huì)降低IVF-ET患者的臨床妊娠率，但是過高的多精受精率可能會(huì)降低臨床妊娠率[18]。

精子作為一種高分化細(xì)胞，早先的研究一直認(rèn)為精子通過受精只傳遞了基因組DNA，并未攜帶有任何參與蛋白質(zhì)合成的RNA，早期胚胎的發(fā)育主要受卵母細(xì)胞質(zhì)量影響[19]。但近些年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，精子通過受精向卵母細(xì)胞傳遞了精子中的RNAs，證實(shí)精子質(zhì)量是影響IVF-ET胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局的重要因素[20-21]。本研究選取IVF-D周期作為研究對(duì)象，盡可能降低精子因素對(duì)胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局的影響。

本研究結(jié)果表明，對(duì)照組和低頻多精組的正常受精率(2PN率)相似，且均顯著高于高頻多精組(P<0.05)。多精受精的發(fā)生，提示精子獲能良好，同時(shí)反應(yīng)卵母細(xì)胞具備良好的接受精子的能力。本研究的低頻多精組通常包括1～2枚多精受精合子，數(shù)量有限，可能不會(huì)對(duì)2PN率造成不利影響。然而，高頻多精組由于多精受精合子數(shù)量較多，部分患者甚至僅有1～2枚正常受精合子，其余均為多精受精合子，大量多精受精合子的出現(xiàn)降低了2PN率。本研究發(fā)現(xiàn)，各組間卵裂率、優(yōu)胚率及囊胚形成率比較均無顯著性差異(P>0.05)，表明多精受精的發(fā)生不影響早期胚胎的發(fā)育。本研究結(jié)果表明，多精受精組患者通常有著理想的獲卵數(shù)，獲卵數(shù)佳表明患者對(duì)促排卵方案反應(yīng)好，多精受精合子的出現(xiàn)可能與卵母細(xì)胞的過熟或未熟相關(guān)，而其它卵母細(xì)胞處于理想的成熟狀態(tài)，可以形成優(yōu)胚，并成功發(fā)育成囊胚。

對(duì)照組和低頻多精組的種植率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率均略高于高頻多精組，流產(chǎn)率略低于高頻多精組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入本研究的周期均為第1次新鮮胚胎移植周期，各組患者的優(yōu)胚率相似，且均在50%以上。因此，高頻多精組較低的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率可能與胚胎質(zhì)量無關(guān)。為了進(jìn)一步分析原因，我們比較了各組患者的單胚胎移植率和囊胚移植率，我們發(fā)現(xiàn)各組間單胚胎移植率相似，高頻多精組的囊胚移植率略高于對(duì)照組和低頻多精組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胚胎基因組通常在8細(xì)胞時(shí)期開始激活，大量研究表明，囊胚移植較卵裂期胚胎移植可以獲得更為理想的臨床結(jié)局[22-23]。高頻多精組的囊胚移植率較高，而囊胚移植率的提升并未改善臨床結(jié)局，活產(chǎn)率反而較其它兩組有所下降。本中心早期針對(duì)卵裂期胚胎移植患者，通常建議移植兩枚胚胎。若是囊胚移植，且有優(yōu)質(zhì)囊胚，通常建議選擇單囊胚移植。高頻多精組囊胚移植成功率略有降低，可能與非整倍體囊胚移植比例升高相關(guān)。有研究通過延時(shí)攝像系統(tǒng)(Time-lapse)對(duì)高頻多精受精周期中正常受精胚胎進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，兩例多PN合子≥5枚且僅有1枚2PN合子的常規(guī)IVF受精周期中，唯一的2PN合子均出現(xiàn)了兩細(xì)胞多核現(xiàn)象[24]。高頻多精組囊胚移植活產(chǎn)率的下降可能是卵裂球多核來源的囊胚移植比率升高所致。

綜上，IVF-D周期多精受精的發(fā)生，通常提示我們此類患者卵母細(xì)胞胞質(zhì)和核的成熟情況可能異常，這對(duì)助孕治療中促排卵和授精方案的制定有一定的提示作用。本研究認(rèn)為IVF-D周期高頻多精受精的發(fā)生不影響胚胎的發(fā)育，但可能會(huì)降低活產(chǎn)率。由于本研究納入樣本數(shù)有限，可能造成結(jié)果的片面性，今后還需進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，深入探討以得到更具說服力的結(jié)論。