固定時(shí)間原核評估中0PN來源胚胎的發(fā)育潛能及其染色體整倍體率研究

趙海靜，袁萍，趙珺，冀曉慧，張清學(xué)，王文軍

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120)

在常規(guī)IVF過程中，常通過原核出現(xiàn)來評估卵母細(xì)胞的受精情況。正常受精是指受精后16～20 h內(nèi)觀察到受精卵中有2個清晰的原核(2PN)和2個極體(2PB)[1]。不具備以上形態(tài)學(xué)特征的受精卵，如零原核(0PN)等被稱為異常受精[2]。有11.3%～20.0%的成熟卵母細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)0PN現(xiàn)象[3]。行IVF后第1天原核觀察為0PN的成熟卵母細(xì)胞在后續(xù)的發(fā)育過程中會有兩種結(jié)局：(1)沒有發(fā)生分裂，處于未受精狀態(tài)，我們稱之為0PN卵母細(xì)胞；(2)能夠繼續(xù)發(fā)育到第1次分裂，即為0PN來源胚胎。根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會實(shí)驗(yàn)室指南[2]，不建議移植0PN來源胚胎。但是，有很多研究者對0PN來源胚胎進(jìn)行了大量的細(xì)胞遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，部分0PN來源胚胎為二倍體胚胎，并且有4.4%～37.2%的0PN來源胚胎能夠發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚[4-6]。以上研究提示，在觀察受精時(shí)沒有原核的成熟卵母細(xì)胞可能實(shí)際上是含有2PN的受精卵，沒有觀察到2PN的主要原因可能是在固定時(shí)間進(jìn)行受精評估很容易錯過原核觀察[7]。

正常受精的卵母細(xì)胞其原核消失大約發(fā)生在受精后的23～25 h，而發(fā)育速度快的胚胎其原核消失可能早于發(fā)育速度正常的胚胎[8-9]。所以，固定時(shí)間原核評估為0PN但能夠繼續(xù)分裂的0PN來源胚胎，也許是發(fā)育速度快的胚胎，只是在觀察受精時(shí)原核已經(jīng)消失。胚胎發(fā)育過程中的2個重要時(shí)間截點(diǎn)為：(1)從受精開始到原核消失的時(shí)間間隔稱為tPNf；(2)從受精開始到第1次細(xì)胞分裂的時(shí)間間隔稱為t2[10]。Kobayashi等[11]研究發(fā)現(xiàn)：(1)使用延時(shí)攝像(Time-lapse)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行原核評估時(shí)，0PN來源胚胎的發(fā)生率顯著低于固定時(shí)間原核評估方法(0.0% vs. 8.3%，P<0.05)；(2)發(fā)育速度快的胚胎其原核消失早于發(fā)育速度正常的胚胎；(3)在固定時(shí)間原核評估時(shí)，0PN來源胚胎的t2顯著短于2PN來源胚胎[(22.4±1.46)h vs.(27.3±3.32)h，P<0.05]，這說明0PN來源胚胎更早開始分裂，其發(fā)育速度更快；(4)通過Time-lapse觀察受精后48 h內(nèi)2PN來源胚胎的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，t2和tPNf參數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示原核消失越早細(xì)胞開始分裂越早，發(fā)育速度也越快；(5)移植0PN來源囊胚能夠獲得健康嬰兒。因此，大部分0PN來源且發(fā)育速度快的胚胎是由于原核消失早，導(dǎo)致固定時(shí)間觀察時(shí)錯過了原核的出現(xiàn)，因此被錯誤地判斷為0PN來源胚胎。在我們中心常規(guī)使用固定時(shí)間原核評估方法，可能錯過原核觀察而出現(xiàn)一定比例的0PN來源胚胎。本文擬通過比較固定時(shí)間原核評估中的0PN來源胚胎和2PN來源胚胎的Day 2(D2)和D3卵裂球數(shù)及其囊胚培養(yǎng)結(jié)局，從形態(tài)學(xué)特征來探究0PN來源胚胎的發(fā)育速度及發(fā)育潛能；并通過比較IVF-0PN來源囊胚與植入前遺傳學(xué)檢測-單基因病(PGT-M)周期中2PN來源囊胚的染色體整倍體率，從遺傳學(xué)角度評估0PN來源胚胎的真實(shí)染色體狀態(tài)。本研究為分析0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值，提高胚胎利用率提供了理論依據(jù)，也為0PN來源胚胎的臨床移植提供參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年10月至2020年9月于本中心行常規(guī)IVF治療的20對不孕不育夫婦的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)控制性促排卵方案為長方案；(2)D1原核觀察為0PN或2PN。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)D1原核觀察為1PN、3PN或多PN；(2)D1卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為MI、GV、退化或空透明帶。

共納入20個周期的183枚卵母細(xì)胞。行IVF后D1固定時(shí)間原核評估，沒有原核的成熟卵母細(xì)胞共67枚(0PN卵母細(xì)胞14枚，0PN來源胚胎53枚)，2PN來源胚胎共116枚。剔除14枚0PN卵母細(xì)胞后，根據(jù)原核評估以及細(xì)胞分裂情況分為兩組：0PN胚胎組(0PN來源胚胎，n=53)和2PN胚胎組(2PN來源胚胎，n=116)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：入組患者均采用長方案進(jìn)行促排卵。陰道B超監(jiān)測卵泡生長情況，當(dāng)B超監(jiān)測有1～2個卵泡直徑≥18 mm時(shí)，給予肌肉注射HCG(珠海麗珠)10 000 U，注射后36～38 h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。在體視顯微鏡下收集卵泡液中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，并置于G-IVF液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)。

2.精液收集及處理：取卵當(dāng)天男方以手淫法采集精液，待精液液化后，通過密度梯度離心及上游法處理，從而獲得符合IVF受精要求的優(yōu)質(zhì)精子。

3.IVF及原核觀察：獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)4～6 h后行IVF，加精濃度為0.3×106/ml。授精16～20 h后評估原核情況，受精卵中出現(xiàn)兩個原核的為2PN，未見原核的為0PN。

4.胚胎培養(yǎng)及發(fā)育評估：去除顆粒細(xì)胞后，將胚胎轉(zhuǎn)移至G1-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中，置于37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至D3。依據(jù)之前文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[12]，在D2和D3分別進(jìn)行卵裂期胚胎的發(fā)育評估，并重點(diǎn)關(guān)注卵裂球數(shù)量。在D3將胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。在D5和D6分別評估囊胚發(fā)育情況，依據(jù)Gardner評分系統(tǒng)[13]，綜合囊胚擴(kuò)張狀態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育情況對囊胚質(zhì)量進(jìn)行全面評估。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚發(fā)育分為6個時(shí)期：1期為早期有腔室囊胚，囊胚腔體積<胚胎總體積的1/2；2期為囊胚腔體積≥胚胎總體積的1/2；3期為擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期為囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期為正在孵出，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期為孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級。其中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級：A級為細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級為細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級為細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級：A級為上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級為上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級為上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成，細(xì)胞很少。本中心定義可利用囊胚為透明帶擴(kuò)張程度≥3期，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分至少1項(xiàng)優(yōu)于C級；優(yōu)質(zhì)囊胚為透明帶擴(kuò)張程度≥3期，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分為BB及以上。

5.囊胚活檢：對D5或D6的可利用囊胚，使用30 μm活檢針(Cook，美國)輕輕吸入5～6個滋養(yǎng)層細(xì)胞并通過激光切割法獲得活檢細(xì)胞，再將活檢細(xì)胞裝入含5 μl磷酸鹽緩沖液(江蘇億康基因)的無RNA/DNA酶的小管中，儲存于-80℃冰箱待進(jìn)行植入前遺傳學(xué)檢測以分析染色體狀態(tài)。

6.觀察指標(biāo)：比較兩組間胚胎發(fā)育潛能情況，包括D2和D3卵裂球數(shù)、囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率以及染色體整倍體率。囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%；可利用囊胚率=可用囊胚數(shù)/形成囊胚數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/形成囊胚數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、夫妻雙方的一般資料

本研究共納入20對不孕不育夫婦。女方平均年齡為(33.70±5.95)歲，平均獲卵數(shù)為(14.85±9.47)個；男方平均精子正常形態(tài)率為(3.83±1.54)%，平均精子頂體酶活性為(55.20±29.48)μIU/106精子(表1)。

表1 納入研究夫妻雙方的一般資料(-±s)

二、兩組間胚胎發(fā)育潛能比較

0PN胚胎組D2卵裂球數(shù)、D3卵裂球數(shù)、囊胚形成率、可利用囊胚率均顯著高于2PN胚胎組(P<0.05)；0PN胚胎組的優(yōu)質(zhì)囊胚率略高于2PN胚胎組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

三、不同來源囊胚的染色體整倍體率比較

為了分析0PN來源胚胎的染色體是否正常，我們對0PN來源囊胚進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢及染色體篩查。根據(jù)不同來源囊胚分為兩組：0PN來源囊胚為0PN囊胚組(n=42)，選取同一時(shí)期的PGT-M周期中2PN來源囊胚為2PN囊胚組(n=251)。比較兩組間染色體整倍體率發(fā)現(xiàn)，0PN囊胚組的染色體整倍體率略高于2PN囊胚組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 不同來源囊胚組間染色體整倍體率比較[(-±s)，%]

討 論

原核觀察是目前評估受精與否的常用方法，然而由于雌雄原核的不同步發(fā)育會導(dǎo)致固定時(shí)間的原核觀察不完全準(zhǔn)確。因此，在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)未觀察到原核，并不一定提示受精失敗[1]。受精時(shí)表現(xiàn)為0PN但能夠繼續(xù)發(fā)育到第1次卵裂，即為0PN來源胚胎[11]。

0PN來源胚胎是源自于正常受精或異常受精很難確定。Lim等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在合子期丟棄的0PN來源胚胎中有66%是二倍體，這說明一定比例的0PN來源胚胎實(shí)際上是2PN來源胚胎。原核的誤判主要原因是由于在固定時(shí)間原核評估很容易錯過原核的出現(xiàn)[7]。Kobayashi等[11]通過Time-lapse對胚胎進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，發(fā)育速度快的胚胎其原核消失要早于發(fā)育速度正常的胚胎，因此使用固定時(shí)間原核評估時(shí)，發(fā)育速度快的胚胎因原核已經(jīng)消失而錯過原核觀察，從而被誤判為0PN來源胚胎。這一結(jié)論支持了我們的研究，本文結(jié)果顯示，0PN來源胚胎D2和D3的卵裂球數(shù)均顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05)，這說明0PN來源胚胎的發(fā)育速度快于2PN來源胚胎，而這些0PN來源胚胎很可能源自于正常受精，因原核消失得早，導(dǎo)致固定時(shí)間原核評估時(shí)未觀察到原核。有研究認(rèn)為，發(fā)育速度快的胚胎擁有更高的發(fā)育能力[15]。Fu等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，快速發(fā)育的0PN來源胚胎有更好的發(fā)育潛能。Kobayashi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，原核消失較早的胚胎其囊胚形成率(75.0% vs. 67.1%)及優(yōu)質(zhì)囊胚率(47.2% vs. 44.5%)均略高于原核消失較晚的胚胎，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。我們的研究結(jié)果與之一致，如表2中數(shù)據(jù)顯示：0PN來源胚胎的囊胚形成率和可利用囊胚率均顯著高于2PN來源胚胎(P<0.05)，其優(yōu)質(zhì)囊胚率略高于2PN來源胚胎，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

胚胎基因組激活開始于4～8細(xì)胞時(shí)期，經(jīng)過3 d的體外培養(yǎng)，胚胎逐漸表達(dá)自身基因[17]。卵裂期胚胎發(fā)育并形成囊胚，表明胚胎基因組已經(jīng)激活，能夠發(fā)育至囊胚的胚胎其染色體異常率較低，因此可以通過延長體外培養(yǎng)時(shí)間來篩選出異常受精的0PN來源胚胎[18]。我們臨床常規(guī)策略是將0PN來源胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，若形成可利用囊胚則冷凍保存，在患者無2PN來源囊胚可移植的情況下，移植0PN來源囊胚以增加妊娠機(jī)會。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，源自于正常受精的0PN來源胚胎，其囊胚形成率較高；而源自于異常受精的0PN來源胚胎，其囊胚形成率很低?；谝陨辖Y(jié)論和我們的結(jié)果推測，部分0PN來源胚胎很有可能來自于2PN受精卵。因此，我們對這些0PN來源囊胚進(jìn)行了染色體檢測并與臨床同一時(shí)期的PGT-M周期中2PN來源囊胚進(jìn)行比較，結(jié)果表明，IVF-0PN來源囊胚的染色體整倍體率略高于PGT-M-2PN來源囊胚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(76.2% vs.75.7%，P>0.05)，這證實(shí)了大部分0PN來源胚胎的起源不是異常受精，而是沒有觀察到原核的正常受精卵。

0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用仍然是一個有爭議的話題。Chen等[6]研究認(rèn)為，考慮到0PN為異常受精，所以0PN來源胚胎移植應(yīng)該盡可能地結(jié)合植入前遺傳學(xué)檢測。同樣，我們的結(jié)果顯示，0PN來源囊胚存在23.8%(10/42)的染色體非整倍體率。因此，在胚胎移植前對0PN來源胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測是很有必要的，可以確保移植染色體正常的0PN來源胚胎，以避免不良妊娠結(jié)局。本研究的一個優(yōu)點(diǎn)是對所有納入研究的0PN來源囊胚進(jìn)行植入前遺傳學(xué)檢測，獲得了明確的染色體整倍體結(jié)果，能夠?yàn)檫@些胚胎的后期臨床應(yīng)用提供準(zhǔn)確的遺傳學(xué)支持。但我們的研究也有一定的局限性：首先，納入的0PN來源囊胚數(shù)量較少；其次，由于入組患者均未進(jìn)行0PN來源囊胚移植，所以無法隨訪臨床妊娠及新生兒出生結(jié)局。

綜上，在本研究中，使用固定時(shí)間原核評估方法獲得的0PN來源胚胎，其發(fā)育速度及發(fā)育潛能優(yōu)于2PN來源胚胎，并且0PN來源囊胚的染色體整倍體率也略高于同期PGT-M-2PN來源囊胚。提示大部分0PN來源胚胎可能源自于正常受精卵，因而在常規(guī)IVF中，對于固定時(shí)間原核評估為0PN的胚胎來說，直接丟棄非明智之舉，其臨床應(yīng)用價(jià)值需要結(jié)合植入前遺傳學(xué)檢測進(jìn)行重新評估和加以重視。