不同年齡女性D3卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)對(duì)囊胚發(fā)育潛能的影響

李曉艷，許娟娟，伏海燕，王慧，吳蓉花，林瑩，黃夢(mèng)婷，黃旋，陳莉

(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210002)

隨著胚胎序貫培養(yǎng)水平的提高，囊胚培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟。囊胚培養(yǎng)越過了胚胎基因組激活階段，經(jīng)歷了細(xì)胞融合、囊腔的形成與擴(kuò)大，并淘汰了一些發(fā)育潛能較差的胚胎。囊胚移植還有利于增加子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的同步性，因此囊胚移植周期的臨床妊娠率和著床率有顯著升高[1]。但是囊胚培養(yǎng)也有培養(yǎng)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，一般囊胚形成率為40%～60%，長時(shí)間的培養(yǎng)和篩選過程，可能會(huì)導(dǎo)致患者無可移植囊胚，給患者造成經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。更重要的是體外培養(yǎng)時(shí)間延長也可能對(duì)印記基因有一定影響，從而影響子代遠(yuǎn)期安全[2]。因此現(xiàn)階段絕大多數(shù)生殖中心在胚胎培養(yǎng)的第3天(D3)選擇卵裂期胚胎移植或冷凍，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)。眾所周知，女方年齡越大胚胎非整倍體率越高，囊胚形成率越低。胚胎發(fā)育速度與整倍體率和囊胚形成率密切相關(guān)，D3卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)可反映胚胎發(fā)育速度的快慢[3]。女方不同年齡階段的D3卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)對(duì)囊胚形成及妊娠結(jié)局的影響報(bào)道較少。本研究根據(jù)不同女方年齡進(jìn)行分組，旨在研究不同年齡階段不同細(xì)胞數(shù)的卵裂期胚胎對(duì)囊胚形成及移植結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2021年12月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療患者的臨床資料。本研究分為3部分。

研究1：比較D3卵裂期胚胎不同細(xì)胞數(shù)對(duì)囊胚發(fā)育潛能的影響。納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：D3移植或冷凍后，剩余行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎；卵裂期胚胎均為≥Ⅲ級(jí)胚胎；卵裂期胚胎為正常受精(2PN)來源；卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)≥4，碎片率<50%；排除卵子冷凍復(fù)蘇周期。

研究2：比較不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎來源的囊胚對(duì)單囊胚移植結(jié)局的影響，其囊胚的D3卵裂期情況納入/排除標(biāo)準(zhǔn)同研究1。囊胚移植的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：行凍融單囊胚移植的患者；排除子宮畸形、子宮器質(zhì)性病變、生殖道畸形等患者。

研究3：比較不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎對(duì)所形成囊胚的整倍體率的影響，其囊胚D3卵裂期情況納入/排除標(biāo)準(zhǔn)同研究1。胚胎植入前非整倍體檢測(cè)(PGT-A)納入標(biāo)準(zhǔn)：不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)；不明原因反復(fù)種植失??；因女方高齡(≥38歲)需要做整倍體檢測(cè)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：因活檢細(xì)胞數(shù)不足或擴(kuò)增失敗導(dǎo)致無法檢測(cè)或檢測(cè)失敗的胚胎；夫妻一方患有單基因病。

二、研究分組

研究1：共納入行囊胚培養(yǎng)的29 314枚D3卵裂期胚胎。按女方年齡分為<35歲組(n=23 778)和≥35歲組(n=5 536)兩組；兩組中再根據(jù)D3卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)分為4細(xì)胞、5細(xì)胞、6細(xì)胞、7細(xì)胞、8細(xì)胞、9細(xì)胞、10細(xì)胞、11+細(xì)胞、融合期胚胎9個(gè)亞組。分析不同年齡組不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。

研究2：共納入2 402個(gè)單囊胚移植周期。按女方年齡分為<35歲組(n=1 887)和≥35歲組(n=515)兩組；兩組中再根據(jù)囊胚來源的D3胚胎細(xì)胞數(shù)不同分為3個(gè)亞組，分別是4～6細(xì)胞、7～9細(xì)胞和≥10細(xì)胞+融合期。分析不同年齡組不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎所形成的囊胚的凍融單囊胚移植結(jié)局。

研究3：共納入1 069個(gè)行PGT-A檢測(cè)的囊胚。按女方年齡分為<35歲組(n=609)和≥35歲組(n=460)兩組；兩組中的亞細(xì)胞分組同研究2。分析不同年齡組不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎對(duì)所形成囊胚的整倍體率的影響(研究2與研究3的數(shù)據(jù)均篩選于研究1)。

三、診療回顧

2.胚胎質(zhì)量評(píng)估：受精卵培養(yǎng)至D3，根據(jù)ASEBIR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分。根據(jù)卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)、碎片率、卵裂球大小均勻程度、是否有空泡以及透明帶狀況等將卵裂期胚胎進(jìn)行等級(jí)評(píng)分，評(píng)為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)可移植或冷凍，Ⅳ級(jí)胚胎丟棄。剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)，培養(yǎng)至D5/D7，根據(jù)Gardner囊胚評(píng)分法[5]進(jìn)行評(píng)分，≥3BC/3CB的囊胚進(jìn)行囊胚冷凍。卵裂期胚胎和囊胚冷凍及解凍均按照加藤試劑盒(Kitazato，日本)使用說明書進(jìn)行玻璃化冷凍和復(fù)蘇。

3.囊胚活檢：囊胚的觀察在D5～7進(jìn)行，對(duì)所形成的可利用囊胚(≥3BC/3CB)予以活檢?；顧z時(shí)，在遠(yuǎn)離細(xì)胞團(tuán)的位置將透明帶進(jìn)行激光打孔，用活檢針緩緩吸取4～5枚滋養(yǎng)層細(xì)胞，激發(fā)3～4次激光切割細(xì)胞連接最薄弱處，使目標(biāo)滋養(yǎng)層細(xì)胞與囊胚分離。取出的滋養(yǎng)層細(xì)胞置于PCR管中備檢?；顧z細(xì)胞行遺傳學(xué)檢測(cè)，活檢后行單囊胚玻璃化冷凍。檢測(cè)結(jié)果為46，XN者為整倍體胚胎。

4.凍融囊胚移植：根據(jù)月經(jīng)周期是否規(guī)律選擇內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。對(duì)于月經(jīng)周期規(guī)律的患者采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜；對(duì)于月經(jīng)周期不規(guī)律的患者采用激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜。經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm以上開始轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，同時(shí)陰道給藥行黃體支持，5 d后行囊胚移植。每周期移植1枚復(fù)蘇囊胚，移植后繼續(xù)黃體支持到孕11周。移植后4周行B超檢查，子宮腔內(nèi)見孕囊或原始心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

5.隨訪：與孕期的患者保持電話隨訪。臨床妊娠率和活產(chǎn)率的統(tǒng)計(jì)日期截止到2021年7月13日。

四、觀察指標(biāo)

囊胚形成率=(2期及以上的囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù))×100%；可利用囊胚形成率=(≥3BC/3CB的囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù))×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=(≥3BB的囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù))×100%；臨床妊娠率=(超聲下能檢測(cè)到孕囊或胎心搏動(dòng)的妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù))×100%；早期流產(chǎn)率=(孕周<12周的流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù))×100%；整倍體率=(整倍體胚胎數(shù)/總活檢胚胎數(shù))×100%。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、D3不同細(xì)胞數(shù)卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局

本研究共納入29 314個(gè)行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎。其中，<35歲組23 778枚，≥35歲組5 536枚。兩組根據(jù)行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)不同(4細(xì)胞、5細(xì)胞、6細(xì)胞、7細(xì)胞、8細(xì)胞、9細(xì)胞、10細(xì)胞、11+細(xì)胞、融合期胚胎)分為不同亞組比較各組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(任意兩組之間均進(jìn)行了比較)，且按照囊胚形成率對(duì)D3細(xì)胞數(shù)亞組進(jìn)行了排序(表1)。

<35歲組中，8細(xì)胞亞組囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均最高，與其他細(xì)胞數(shù)亞組比較差異顯著(P<0.05)；融合期胚胎亞組次之，11+細(xì)胞亞組囊胚發(fā)育潛能位居第三。各細(xì)胞數(shù)胚胎亞組囊胚發(fā)育潛能層次明顯，按照可利用囊胚形成率從高到低依次排序?yàn)椋?細(xì)胞>融合期>11+細(xì)胞=9細(xì)胞>10細(xì)胞=7細(xì)胞>6細(xì)胞>5細(xì)胞=4細(xì)胞[>示前者顯著高于后者(P<0.05)，=示前后兩者間無顯著差異(P>0.05)](表1)。

表1 不同細(xì)胞數(shù)D3卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)情況比較[n(%)]

≥35歲組中，8細(xì)胞亞組具有最好的發(fā)育潛能，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于融合期亞組(P<0.05)。融合期亞組發(fā)育潛能僅次于8細(xì)胞亞組，而9細(xì)胞亞組的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于10細(xì)胞亞組，7細(xì)胞亞組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于10細(xì)胞亞組(P<0.05)。各細(xì)胞數(shù)胚胎亞組按照可利用囊胚形成率從高到低依次排序?yàn)椋?細(xì)胞=融合期>9細(xì)胞=7細(xì)胞=11+細(xì)胞=10細(xì)胞>6細(xì)胞=4細(xì)胞>5細(xì)胞[>示前者顯著高于后者(P<0.05)，=示前后兩者間無顯著差異(P>0.05)](表1)。

二、D3不同細(xì)胞數(shù)胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植結(jié)局

本研究共納入2 402個(gè)單囊胚凍融移植周期。其中，<35歲組1 887周期，≥35歲組515周期。兩組根據(jù)囊胚來源的D3胚胎細(xì)胞數(shù)各分為3個(gè)亞組，分別是4～6細(xì)胞、7～9細(xì)胞和≥10細(xì)胞+融合期。各細(xì)胞數(shù)亞組對(duì)應(yīng)患者的基本情況和移植結(jié)局如表2所示。

表2 不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植一般資料及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，n(%)]

在<35歲組中，7～9細(xì)胞亞組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于4～6細(xì)胞亞組(P值分別為0.028、0.041)；≥10細(xì)胞+融合期亞組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率亦顯著高于4～6細(xì)胞亞組(P值分別為0.015、0.022)；7～9細(xì)胞亞組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率與≥10細(xì)胞+融合期亞組相似(P值分別為0.404、0.413)。在≥35歲組中，3個(gè)亞組來源的囊胚凍融單囊胚移植妊娠結(jié)局無顯著性差異(P>0.05)。<35歲組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于≥35歲組(P=0.000)。

三、D3不同細(xì)胞數(shù)對(duì)囊胚整倍體率的影響

本研究共納入1 069個(gè)行PGT-A的囊胚，其中<35歲組609個(gè)，≥35歲組460個(gè)。兩組根據(jù)D3胚胎細(xì)胞數(shù)各分為3個(gè)亞組，分別是4～6細(xì)胞、7～9細(xì)胞和≥10細(xì)胞+融合期。如表3顯示，在<35歲、≥35歲組兩組內(nèi)，各細(xì)胞數(shù)來源的囊胚整倍體率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；≥35歲組的總體整倍體率顯著低于<35歲組(P=0.000)。

表3 不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎來源的囊胚活檢后整倍體率比較[n(%)]

討 論

影響囊胚發(fā)育潛能的因素有很多，例如患者年齡、原核數(shù)目、卵裂期胚胎質(zhì)量及培養(yǎng)體系等[6-10]。女方年齡為公認(rèn)的影響因素，目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于婦女高齡沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道女方年齡≥35歲時(shí)，卵母細(xì)胞和胚胎非整倍體率增加[11]，而染色體異常是導(dǎo)致IVF植入失敗、流產(chǎn)、胎兒發(fā)育異常等的重要因素。大多數(shù)文獻(xiàn)支持將婦女年齡在35歲及以上定義為高齡，因此本研究將女方年齡按照<35歲(年輕組)和≥35歲(高齡組)進(jìn)行分組，研究2PN來源的不同D3細(xì)胞數(shù)卵裂期胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局。研究結(jié)果顯示高齡組的整倍體率顯著低于年輕組，這在一定程度上解釋了高齡組的臨床妊娠率及活產(chǎn)率低于年輕組。

近幾年關(guān)于囊胚形成的研究通常按行囊胚培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分組研究[12-13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，囊胚形成率會(huì)隨著行囊胚培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞數(shù)目的增加而升高[14]，而11+細(xì)胞胚胎在可利用囊胚形成上與8～10細(xì)胞胚胎表現(xiàn)出相似的發(fā)育潛能[15]。研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)育較快的胚胎與8細(xì)胞胚胎有相似的妊娠結(jié)局[16]；通過Time-lapse挑選出發(fā)育較快的胚胎同樣有較好的妊娠結(jié)局[17-18]。本研究結(jié)果顯示在年輕、高齡兩組中，8細(xì)胞胚胎的囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均最高。在年輕組，融合期胚胎的發(fā)育潛能僅次于8細(xì)胞胚胎，其囊胚形成率和可利用囊胚形成率顯著高于11+細(xì)胞胚胎。11+細(xì)胞胚胎的囊胚形成率位居第三，其優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于9細(xì)胞胚胎。融合期胚胎與11+細(xì)胞胚胎都屬于發(fā)育比較快的胚胎，本研究結(jié)果與前述研究類似。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，發(fā)育較快的胚胎中約70%染色體異常者在囊胚形成的過程中將會(huì)被淘汰，因此形成較高質(zhì)量的囊胚有更高的發(fā)育潛能[19]。而在高齡組中，7～10細(xì)胞胚胎以及11+細(xì)胞胚胎表現(xiàn)出相近的發(fā)育潛能，可利用囊胚形成率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于發(fā)育遲緩的胚胎，本研究結(jié)果顯示其囊胚形成率與可利用囊胚率較低，與之前的研究[15]類似，在高齡組中4細(xì)胞胚胎要優(yōu)于5細(xì)胞胚胎，6細(xì)胞胚胎要明顯優(yōu)于4細(xì)胞胚胎和5細(xì)胞胚胎。

通常生殖領(lǐng)域醫(yī)生根據(jù)卵裂期胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎予移植或冷凍。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，在卵母細(xì)胞受精后D3胚胎應(yīng)發(fā)育到8細(xì)胞，生長過慢或過快的胚胎染色體異常的概率增加，所以通常會(huì)選擇7～9個(gè)細(xì)胞的胚胎進(jìn)行移植或冷凍。但是有研究發(fā)現(xiàn)僅以D3胚胎形態(tài)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能不夠精確[20]，甚至對(duì)公認(rèn)的D3優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)提出了質(zhì)疑。細(xì)胞數(shù)作為影響評(píng)級(jí)的關(guān)鍵因素，在年輕組中只有Ⅲ級(jí)評(píng)分的11+細(xì)胞胚胎的發(fā)育潛能甚至優(yōu)于Ⅰ、Ⅱ級(jí)的7細(xì)胞、9細(xì)胞胚胎，據(jù)此我們也認(rèn)為目前的細(xì)胞評(píng)級(jí)體系可能不夠精確，有待于完善。在研究不同細(xì)胞數(shù)D3胚胎來源囊胚的妊娠結(jié)局時(shí)，在兩個(gè)年齡組中根據(jù)細(xì)胞發(fā)育的快慢分了3個(gè)亞組。結(jié)果顯示，年輕組中整體的臨床妊娠率、活產(chǎn)率及整倍體率均顯著高于高齡組(P<0.05)，這一結(jié)果說明年輕組中較高的單囊胚移植臨床妊娠率可能與其較高的整倍體率有關(guān)。在年輕組中，4～6細(xì)胞胚胎來源的囊胚凍融單囊胚移植的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著低于其他細(xì)胞數(shù)胚胎來源者，而各細(xì)胞數(shù)胚胎來源的囊胚整倍體率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果說明低細(xì)胞數(shù)胚胎來源的囊胚妊娠結(jié)局差的原因可能不是由于整倍體原因，或許是由于其他原因。在高齡組中，各細(xì)胞數(shù)胚胎來源的囊胚臨床妊娠率、活產(chǎn)率及整倍體率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果表明，高齡組中凍融單囊胚移植的妊娠結(jié)局受D3細(xì)胞數(shù)影響不明顯，只要有囊胚形成則能保持較滿意的妊娠率。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于高齡患者進(jìn)行囊胚培養(yǎng)可以篩選出具有較高發(fā)育潛能的胚胎，淘汰部分發(fā)育潛能較差的胚胎，最終提高活產(chǎn)率[21]。

本研究也存在一些局限性：首先，本研究只納入了D3胚胎的細(xì)胞數(shù)，而沒有對(duì)其他方面進(jìn)行研究。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)比卵裂球均一情況以及胚胎碎片更能預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能，生長速率是有力的指標(biāo)之一[22-23]。其次，上述的3部分研究中亞組樣本數(shù)量差距較大，例如8細(xì)胞亞組(及8細(xì)胞所在的亞組)數(shù)量相對(duì)較多，個(gè)別亞組數(shù)量較少。卵母細(xì)胞受精后66～68 h應(yīng)形成8細(xì)胞，8細(xì)胞比例較高是胚胎發(fā)育的自然規(guī)律，只是有的胚胎卵裂相對(duì)過快或過慢，但這部分胚胎并不是多數(shù)，所以出現(xiàn)個(gè)別亞組數(shù)量較少。因此，后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量來驗(yàn)證本研究的結(jié)論。

綜上所述，在年輕(<35歲)和高齡(≥35歲)兩個(gè)年齡組中，D3卵裂期胚胎細(xì)胞數(shù)與囊胚形成呈現(xiàn)出不同的發(fā)育規(guī)律，與傳統(tǒng)的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)了一定差異。本研究為臨床上胚胎篩選移植策略提供了以下幾點(diǎn)參考：對(duì)于年輕患者在囊胚移植挑選胚胎時(shí)，當(dāng)囊胚評(píng)分一致時(shí)盡量不選擇D3低細(xì)胞數(shù)胚胎來源的囊胚；對(duì)于高齡患者，只要有囊胚形成其妊娠結(jié)局不受D3胚胎細(xì)胞數(shù)影響；在D3胚胎評(píng)分時(shí)，可以按照不同年齡進(jìn)一步細(xì)化細(xì)胞數(shù)，更合理地選擇移植或冷凍的胚胎，為患者提供更佳的個(gè)體化治療方案。