犢牛腹瀉病原學(xué)檢測及體外藥物敏感性試驗(yàn)

趙紅霞，呂向聰，宋 晨，郭文瑞，郭 宇，王建龍，周偉光,樊宏亮

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

我國犢牛腹瀉發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家[1]，尤其在我國氣候寒冷、干燥的北方地區(qū)。目前臨床中大腸桿菌感染的疾病主要通過抗菌藥物進(jìn)行治療[2]，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性，使其治療效果下降或無效。為了提高犢牛腹瀉的治愈率，本試驗(yàn)對內(nèi)蒙古呼和浩特周邊地區(qū)犢牛場腹瀉犢牛的腹瀉病料進(jìn)行病原學(xué)檢測，并對其中的主要病原菌進(jìn)行體外藥物敏感性測定，旨在篩選出對其敏感的抗菌藥物，從而為有效防治犢牛腹瀉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2018年10月—2019年6月,在內(nèi)蒙古呼和浩特周邊地區(qū)4個(gè)犢牛養(yǎng)殖場選取精神萎靡、食欲不振或體溫升高，排淡黃粥樣或白色水樣糞便，或糞便帶有泡沫、腥臭味、腐臭味的腹瀉犢牛，共采樣50份。

1.2 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MK)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；腸桿菌生化鑒定管以及四環(huán)素(30 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、氨芐西林(10 μg/片)、頭孢喹肟(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、多黏菌素B(30 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)共10種藥敏片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；病毒基因DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自洪陽生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試驗(yàn)儀器 智能生化培養(yǎng)箱，購自寧波江南儀器廠；電子天平，購自德國賽多科斯股份公司；超凈工作臺，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電泳儀，購自北京市六一儀器廠。

1.4 病毒的檢測 對常引起犢牛腹瀉的4種病毒[牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛冠狀病毒(BCoV)和牛細(xì)小病毒(BPV)]進(jìn)行檢測,所用引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行設(shè)計(jì),由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。病毒采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和PCR進(jìn)行檢測。取被檢糞樣1 g，加生理鹽水4 mL混勻;反復(fù)凍融2次，8 000 r/min離心10 min，取上清，用病毒 DNA/RNA 提取試劑盒提取病毒核酸樣品，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板3 μL，上、下游引物各 1 μL，PremixTaq10 μL,ddH2O 5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖平板凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 病毒檢測引物序列

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與純化 在超凈工作臺下，將病料置于滅菌生理鹽水中混勻，接種于已配制好的無菌營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24～36 h進(jìn)行增菌。待菌液呈渾濁時(shí)，接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取有紫黑色并帶有綠色金屬光澤的單菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，得到單一的鮮紅菌落，進(jìn)行革蘭染色鏡檢和生化鑒定。

1.6 分離菌的生化鑒定 用接種針挑取已分離純化的單一菌落，進(jìn)行三糖鐵、五糖發(fā)酵、IMViC試驗(yàn)[包括靛基質(zhì)(I)試驗(yàn)、甲基紅(M)試驗(yàn)、二乙酰(V)試驗(yàn)、檸檬酸鹽(C)試驗(yàn)]、尿素酶試驗(yàn)進(jìn)行生化鑒定；能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解蔗糖，三糖鐵斜面和底部均為黃色，且有氣體產(chǎn)生，不產(chǎn)H2S，IMViC試驗(yàn)結(jié)果為“++--”的細(xì)菌判定為大腸桿菌。

1.7 分離菌的PCR鑒定 將生化鑒定疑似大腸桿菌的菌樣，以按照TaKaRa細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取的DNA為模板，使用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物序列[2]見表2。PCR反應(yīng)體系(25 μL):模板1.0 μL，引物27F、1492R各0.5 μL,PremixTaq12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，PCR陽性產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序并將結(jié)果上傳到NCBI中進(jìn)行序列比對，確定菌種。

表2 大腸桿菌檢測引物序列

1.8 藥敏試驗(yàn) 采用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇臨床常用的10種藥敏紙片，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)(2009年)進(jìn)行藥敏結(jié)果的判讀，抑菌圈直徑<10 mm判定為耐藥；抑菌圈直徑>15 mm判定為敏感；10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm判定為中介。

2 結(jié)果

2.1 病毒的檢測 病毒病原檢測結(jié)果如表3所示，50份糞樣中BVDV、BRV以及BVDV和BRV混合感染檢出率分別是34%(17/50)、44%(22/50)、16%(8/50)，而BCoV、BPV均為陰性。

表3 犢牛腹瀉糞樣中病原檢測結(jié)果

2.2 分離菌培養(yǎng)特性 分離菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，直徑2～3 mm，邊緣整齊、灰白色，呈半透明的菌落。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊的菌落。在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上形成紫黑色菌落(圖1)，并帶有綠色金屬光澤。革蘭染色鏡檢(圖2)為陰性、兩端鈍圓的小桿菌。

圖1 分離菌在伊紅美蘭平板上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌革蘭染色鏡檢形態(tài)(100×)

2.3 分離菌生化特性 將分離到的39株疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表4。根據(jù)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)和IMViC試驗(yàn)結(jié)果可以得出，分離到的39株疑似大腸桿菌均符合大腸桿菌的生化特性。

表4 疑似大腸桿菌的生化鑒定

2.4 分離菌PCR鑒定 將39株分離菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增條帶大小與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922條帶大小相符(1 500 bp 左右)。

圖3 大腸桿菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

2.5 藥敏試驗(yàn) 39株大腸桿菌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表5和圖4所示，大腸桿菌具有多重耐藥性，并且對四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素的耐藥率最高，均高于90.0%。其次是氟苯尼考(84.6%)、氧氟沙星(79.5%)、氨芐西林(76.9%)、恩諾沙星(74.4%)，但對頭孢喹肟和多黏菌素B具有較強(qiáng)的敏感性，敏感率達(dá)60.0%以上。

圖4 犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥水平

表5 39株分離菌的藥敏試驗(yàn)

3 討論

本試驗(yàn)通過對內(nèi)蒙古呼和浩特周邊地區(qū)部分規(guī)模牛場進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)犢牛腹瀉普遍存在，且嚴(yán)重危害飼養(yǎng)場的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。本試驗(yàn)對50份犢牛腹瀉糞便樣品進(jìn)行BVDV、BRV檢測，結(jié)果顯示，BVDV 檢出率(34%)略高于2015年Deng等[5]報(bào)道的全國奶牛陽性率(32.06%)和2019年孫力等[6]報(bào)道的新疆地區(qū)陽性率(24.6%)，但低于2019年宋維彪等[7]報(bào)道的青海省牦牛陽性率(51.59%)。我國不同地區(qū)BRV的感染率和流行率差異較大，平均流行率介于30%～40%，而歐美等國感染率高達(dá)90%以上[8]。本試驗(yàn)BRV的檢出率為44%，BVDV和BRV混合感染率為16%，說明內(nèi)蒙古呼和浩特周邊地區(qū)存在著嚴(yán)重的病毒性感染，建議加強(qiáng)疫病的防控，同時(shí)在保障安全有效的前提下對持續(xù)感染(Persistent infection，PI)牛開展凈化淘汰。

有研究報(bào)道[9-10]顯示，大腸桿菌感染也是引起犢牛腹瀉的主要原因之一，臨床上根據(jù)大腸桿菌引起的犢牛腹瀉的病理特征和病變情況將其分為敗血型、腸毒血型以及腸炎型，病情嚴(yán)重時(shí)患牛幾天內(nèi)就可能死亡。本試驗(yàn)對50份樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，通過生化鑒定和PCR鑒定共分離出39株大腸桿菌，分離率為78%，與楊斯琴等[11]報(bào)道的內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)牛源致病性大腸桿菌的檢出率(79%)基本一致。斯木古德等[12]報(bào)道的荷斯坦牛新鮮糞便大腸桿菌檢出率為40.12%，與本試驗(yàn)大腸桿菌檢出率相比較低。本試驗(yàn)結(jié)果和其他學(xué)者報(bào)道的研究結(jié)果均表明，大腸桿菌的流行存在著明顯的地域差異性。應(yīng)通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、科學(xué)規(guī)范消毒環(huán)境和用具，預(yù)防犢牛場大腸桿菌病的暴發(fā)。

本試驗(yàn)選取臨床常用的10種抗菌藥進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，39株大腸桿菌對10種抗菌藥的耐藥程度不容樂觀。39株分離菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素、氟苯尼考、氨芐西林、恩諾沙星和氧氟沙星7種抗菌藥物均產(chǎn)生耐藥性，并且耐藥率均高于70%，不推薦臨床中繼續(xù)使用這些抗菌藥。2015年，崔冰冰[13]對中國北方部分規(guī)?；膛龅?4株?duì)倥８篂a大腸桿菌對22種常用抗生素的耐藥情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)對10種以上抗菌藥耐藥的菌株有24株，占比達(dá)70.59%。2016年，劉少昆[14]從北京、天津牛場腹瀉犢牛樣本中共分離到32株強(qiáng)致病性大腸桿菌，并對其多重耐藥性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)天津地區(qū)犢牛大腸桿菌致病株全部為多重耐藥菌株，最多對16種抗菌藥耐藥，其中對14種抗菌藥耐藥的菌株占比最大；北京地區(qū)中僅1株只耐1種藥物，對13種抗菌藥耐藥菌株占比最大。本試驗(yàn)分離菌株對多黏菌素B和頭孢喹肟的敏感性達(dá)60%以上，可在臨床中繼續(xù)使用，但應(yīng)規(guī)范使用。上述數(shù)據(jù)表明，犢牛腹瀉大腸桿菌多重耐藥普遍存在，細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生不僅給動(dòng)物疾病的防治帶來了困難，同時(shí)還給食品安全以及人類健康造成嚴(yán)重的威脅。因此，應(yīng)尋找新型安全天然添加劑作為抗菌藥物的替代品，如黃芪多糖、天蠶素等中草藥，既可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力，又有抗菌功效，且不存在藥物殘留問題[15-17]，同時(shí)要加強(qiáng)平時(shí)的飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體免疫力，減少疾病的發(fā)生。