UFLC-MS/MS法同時測定梔子中5種有效成分的含量

崔 悅，張葆祺，李樂樂，林曉影，馮 波，關(guān) 皎，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

梔子為茜草科植物，其主要藥物部位是干燥成熟果實，能夠涼血解毒[1]。據(jù)文獻(xiàn)報道，梔子具有多種藥理活性，如：抗氧化、抗炎、降壓、保肝、降血糖、抗動脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、抗腫瘤等[2-7]。梔子中的化學(xué)成分眾多，主要包括環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸類、木脂素類、單萜苷類、三萜類等[8-11]。環(huán)烯醚萜苷類為梔子的主要活性成分，本試驗選擇的4個測定指標(biāo)(京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯和京尼平苷酸)屬于環(huán)烯醚萜苷類，綠原酸屬于有機(jī)酸類。研究表明，京尼平苷能夠治療非酒精性脂肪性肝病[12]、保護(hù)老年大鼠軟骨細(xì)胞[13]。京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷具有抗心力衰竭[14]、減少黑色素形成和減輕細(xì)胞毒性[15]等作用。京尼平苷酸具有良好的抗炎作用[16]。去乙酰車葉草苷酸甲酯具有較好的鎮(zhèn)痛作用[17]。綠原酸是一種天然多酚，可以通過調(diào)節(jié)腸道健康進(jìn)而降低仔豬腹瀉率[18]，此外，還具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[19]。

目前，梔子中有效成分的含量測定方法多采用高效液相色譜法[20-22]，其測定成分相對較少且靈敏度低、分析時間較長。本試驗采用的超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UFLC-MS/MS)技術(shù)是將超快速液相色譜和質(zhì)譜有機(jī)結(jié)合的一項新型聯(lián)用技術(shù)，同時具備優(yōu)越的色譜分離能力和質(zhì)譜檢測能力。與高效液相色譜相比，本試驗采用的超快速液相色譜分離速度更快、靈敏度更高、分離度更好，可大大縮短分析時間，提高分離效果，節(jié)省溶劑用量，降低分析成本；另外，本試驗所采用的質(zhì)譜為四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，具有良好的定性、定量能力，能夠?qū)崿F(xiàn)對微量分析物的精準(zhǔn)定量[20-22]。本試驗建立了梔子中5種有效成分的定量分析方法，并測定了其在梔子藥材中的含量，可為梔子在獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域的研究與開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 超高快速液相色譜儀(型號：Prominence UFLC，日本島津公司。儀器配置包括：自動進(jìn)樣器，型號：Prominence SIL-20AHT；二元高壓泵，型號：LC-20AD；柱溫箱，型號：CTO-20A；紫外檢測器，型號：SPD-20A；色譜工作站，型號：LC solution)，三重四極桿質(zhì)譜儀(型號：3200 QTRAP，美國AB Sciex公司)，微型高速萬能試樣粉碎機(jī)(型號：FW80，天津泰斯特公司)，十萬分之一電子天平(型號：CPA 225D，德國Sartorius公司)，數(shù)控聲波清洗器(型號：KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 主要試劑 本試驗所使用的對照品包括京尼平苷(批號：19101705)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷(批號：16120502)、去乙酰車葉草苷酸甲酯(批號：17101701)、京尼平苷酸(批號：19101604)、綠原酸(批號：20121117)，均購自成都普菲德公司，純度均大于98%；乙腈(LC-MS級)，購自美國Fisher公司；甲酸(LC-MS級)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為屈臣氏純凈水；梔子藥材(產(chǎn)地：江西省)，購自吉林市吉林大藥房，經(jīng)鑒定為梔子道地藥材。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脫方式：梯度洗脫(0～7.0 min,10%～25% B)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；平衡時間：5 min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子(Electrospray ion,ESI)源，負(fù)離子和多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple response monitoring,MRM)模式，源噴霧電壓-4 500 V，霧化氣、輔助氣和氣簾氣壓力分別為50、50 psi 和20 psi。京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的MRM參數(shù)見表1。

表1 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的MRM參數(shù)

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液 取京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸對照品適量，精密稱定，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、0.2、0.1、0.1 mg/mL和0.1 mg/mL的儲備液。

1.4.2 供試品溶液 稱得梔子粉末0.5 g于50 mL錐形瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液25 mL，超聲30 min，放冷，濾過。精密量取續(xù)濾液0.5 mL，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 線性關(guān)系及檢測限、定量限 分別精密量取“1.4.1”項下的各對照品儲備液適量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50，v/v)溶液稀釋至刻度，搖勻，得到京尼平苷濃度分別為 5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷濃度分別為 1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL，京尼平苷酸的濃度為 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL，綠原酸濃度分別為 0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL的系列混合對照品溶液。以對照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算各成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。將京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸對照品稀釋后進(jìn)樣，考察其檢測限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)。

1.5.2 精密度試驗 取混合對照品溶液200 μL，各成分濃度為京尼平苷50 μg/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷10.0 μg/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯5.0 μg/mL，京尼平苷酸1.0 μg/mL，綠原酸1.0 μg/mL。連續(xù)進(jìn)樣6 次，并計算各待測成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，分別于0、2、4、8、12 h和24 h，按“1.3”項中色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計算各待測成分峰面積的RSD。

1.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批次梔子樣品，共6 份，按“1.4.2”項方法制備供試品溶液，按“1.3”項中色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計算各待測成分峰面積的RSD和含量。

1.5.5 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的梔子樣品9份，每份0.25 g，精密稱定，加入對照品京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的量相當(dāng)于梔子樣品中各對照品含量的80%、100%和120%，各3份。按“1.4.2”項中操作方法，制備供試品溶液并進(jìn)樣分析，計算各待測成分的回收率和RSD。

1.6 樣品含量測定 取6批梔子樣品，按“1.4.2”項方法制備供試品溶液，按“1.3”項中色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，計算梔子中各成分的含量。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜與色譜圖 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖1，混合對照品和梔子樣品的MRM色譜圖見圖2。

圖1 京尼平苷(A)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷(B)、去乙酰車葉草苷酸甲酯(C)、京尼平苷酸(D)和綠原酸(E)的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

圖2 混合對照品(A)和梔子樣品(B)的MRM色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系及檢測限、定量限 5種有效成分的線性回歸方程見表2。京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸分別在5～200 μg/mL、1.0～40.0 μg/mL、0.5～20.0 μg/mL、0.1～4.0 μg/mL和 0.1～4.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。京尼平苷的檢測限和定量限分別為20 ng/mL和67 ng/mL，京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷的檢測限和定量限分別為10 ng/mL和33 ng/mL，去乙酰車葉草苷酸甲酯的檢測限和定量限分別為10 ng/mL和33 ng/mL，京尼平苷酸的檢測限和定量限分別為5 ng/mL和17 ng/mL，綠原酸的檢測限和定量限分別為3 ng/mL和10 ng/mL。

表2 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的線性回歸方程

2.2.2 精密度試驗 各待測成分峰面積的RSD值：京尼平苷為1.1%、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為2.7%、去乙酰車葉草苷酸甲酯為1.6%、京尼平苷酸為2.2%、綠原酸為1.7%，說明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 各待測成分峰面積的RSD值：京尼平苷為0.9%、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為1.5%、去乙酰車葉草苷酸甲酯為2.3%、京尼平苷酸為2.6%、綠原酸為2.3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.4 重復(fù)性試驗 各待測成分含量平均值和峰面積的RSD值：京尼平苷為5.04%(RSD=1.8%)、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷為0.839%(RSD=1.7%)、去乙酰車葉草苷酸甲酯為0.044 7%(RSD=2.6%)、京尼平苷酸為0.009 91%(RSD=2.4%)、綠原酸為0.024 4%(RSD=2.0%)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 各待測成分的回收率和RSD結(jié)果見表3。

表3 京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的回收率

2.3 樣品含量測定 結(jié)果見表4。

表4 6批梔子樣品中京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的含量

3 討論

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 本試驗采用反相高效色譜系統(tǒng)對梔子中的5種有效成分同時進(jìn)行含量測定，在反相高效色譜中常用的有機(jī)相為甲醇和乙腈，故試驗中比較了這2種溶劑作為有機(jī)相時的分離效果。采用水-甲醇或水-乙腈作為流動相時，分離效果不佳，色譜峰較寬且有一定程度拖尾。本試驗考察了0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)和 0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動相的分離效果，0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作為流動相具有更好的分離效果。分離復(fù)雜混合物時，采用梯度洗脫的方式能夠獲得較好的的分離效果，并能夠縮短分析時間。通過不斷反復(fù)調(diào)整洗脫程序發(fā)現(xiàn)過短的分析時間無法成功分離京尼平苷，最終確定的梯度洗脫條件為：0～7.0 min，10%～25% 乙腈，分析時間僅為7 min。

5種待測物均采用電噴霧離子源(ESI)進(jìn)行分析，負(fù)離子模式下的響應(yīng)高于正離子，因此采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。京尼平苷主要形成m/z433.1的[M+HCOO]-加合離子，京尼平1-β-D龍膽雙糖苷主要形成m/z595.0的[M+HCOO]-加合離子，去乙酰車葉草苷酸甲酯主要形成m/z449.1的[M+HCOO]-加合離子，京尼平苷酸主要形成m/z373.1的[M-H]-加合離子，綠原酸主要形成m/z353.1的[M-H]-加合離子，以上離子靈敏度高、信號較穩(wěn)定。

碰撞能(Collision,energy,CE)影響定量結(jié)果，故需對CE進(jìn)行優(yōu)化。CE較低，在 10～30 eV范圍內(nèi)時，碎片離子少且穩(wěn)定；CE 較高，在30～50 eV范圍內(nèi)時，母離子信號響應(yīng)較差，形成的碎片離子很多。最終確定京尼平苷、京尼平1-β-D龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的CE值分別為-23、-30、-24、-30 eV和-28 eV，在此碰撞能下獲得的質(zhì)譜響應(yīng)良好且穩(wěn)定。

3.2 提取溶劑的選擇 考察不同提取溶劑(純水、100%乙醇溶液，100%甲醇溶液和50%甲醇溶液)的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用50%甲醇溶液提取效率最高，此時京尼平苷、京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、京尼平苷酸和綠原酸的提取率分別為5.16%、0.799%、0.041 5%、0.008 46%和0.024 9%，最終確定50%甲醇溶液為提取溶劑。

3.3 各待測物含量比較 本試驗測定6批梔子中上述5種有效成分的含量，結(jié)果表明，6批梔子的含量均符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定(含梔子苷不少于1.8%，京尼平苷又名梔子苷)。梔子藥材中上述5種活性成分的含量由高到低依次為：京尼平苷>京尼平1-β-D-龍膽雙糖苷>去乙酰車葉草苷酸甲酯>綠原酸>京尼平苷酸。含量最高的京尼平苷是梔子中重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用，其在梔子中含量豐富，藥理作用強(qiáng)，適合大量提取，可用于對牲畜、家禽及寵物的日常疾病預(yù)防與治療[4,23]。本試驗可為相關(guān)獸藥的開發(fā)提供一定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考。

本試驗建立了一種UFLC-MS/MS方法以同時測定梔子中5種有效成分的含量，該方法具有分析速度快、分離效果好、靈敏度高等優(yōu)點。本試驗建立的方法可為中藥梔子在獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考，有助于擴(kuò)大中藥等天然藥物在獸藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為獸藥的開發(fā)提供新思路。