人參皂苷Rb3通過抗氧化應(yīng)激對HT22細(xì)胞氧糖剝奪-復(fù)糖復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

羅 苑，陳 普，段小花，李付惠，馮光泉，常 征，高明菊，詹云靜，李建平，王朝勇

(1.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院，云南 文山 663099；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

腦卒中(Cerebral stroke)又稱中風(fēng)，是一類由于腦血管中的血流和氧氣含量改變所導(dǎo)致大腦損傷的疾病，已成為全球致殘和致死的主要原因之一[1]。其中缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)占所有卒中病例的近80%[2]。對于腦缺血性中風(fēng)，盡早恢復(fù)腦組織的供血供氧是有效手段之一，在臨床的一線治療方法為靜脈注射阿替普酶(tPA)，由于治療時(shí)間窗有限(腦卒中后4.5 h內(nèi)使用)，只有3.0%～8.5%的腦卒中患者能接受該治療[3]。此外，溶栓再灌注的過程也會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的腦功能衰竭，臨床稱為腦缺血-再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[4]。而腦血流中斷和再灌注會(huì)使腦細(xì)胞產(chǎn)生快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[5]。因此溶栓藥物使用受到嚴(yán)格控制，而有效的神經(jīng)保護(hù)藥物可以預(yù)防病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高溶栓治療效果，是挽救缺血半暗帶，治療IS的關(guān)鍵。然而，神經(jīng)保護(hù)藥物在臨床中并未得到預(yù)期的療效，其原因包括研究藥物的治療靶點(diǎn)單一，且研究模型未設(shè)計(jì)缺血再灌注的病理進(jìn)程[6]。因此，探索抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物是十分迫切和重要的。

中醫(yī)藥在治療靶點(diǎn)方面具有突出優(yōu)勢，三七[Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chen]為五加科人參屬植物三七的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛的功效。《本草綱目》記載，三七莖葉“治折傷、跌撲出血，敷之即止，青腫經(jīng)夜即散，余功同根”。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，三七葉皂苷在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)等方面的作用與三七皂苷相似[7]。其中人參皂苷Rb3(C53H90O22)是三七葉中特有的人參皂苷成分，在2015年版《中華人民共和國藥典》第一部中規(guī)定三七葉總皂苷含量以人參皂苷Rb3計(jì)，不得少于10%。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3對腦缺血和腦線粒體損傷具有保護(hù)作用[8-10]。文獻(xiàn)記載和臨床研究都提示，人參皂苷Rb3對于治療CIRI可能具有一定優(yōu)勢。目前，人參皂苷Rb3對CIRI的研究主要局限于腦保護(hù)作用，且主要針對體內(nèi)動(dòng)物模型，其保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。由于氧化應(yīng)激是CIRI的基本病理機(jī)制，本試驗(yàn)通過小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞建立氧糖剝奪-復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)體外腦缺血再灌注模型，研究人參皂苷Rb3對腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為開發(fā)三七莖葉新的應(yīng)用途徑，以及CIRI治療機(jī)制和靶點(diǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HT22細(xì)胞株(上海酶研生物科技有限公司，本實(shí)驗(yàn)室保存)來源于小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，是常用的神經(jīng)細(xì)胞株。

1.1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rb3(萬佳標(biāo)物河南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心，純度≥99.86%)；依達(dá)拉奉Edaravone(EDA，北京索萊寶科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)(上海麥克林生化科技有限公司)；噻唑藍(lán)(Methyl thiazoly tertrazolium，MTT)(上海索橋生物科技有限公司)；杜氏改良培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶(上海逍鵬生物科技有限公司)；RIPA裂解液強(qiáng)(P0013B)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性檢測試劑盒(C0016)、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(S0033S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一氧化氮(Nitric oxide，NO)測定試劑盒(A012-1)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測試盒(A003-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(A001-3)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)測試盒(A005-1)、小鼠細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(H190-1-1)(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.1.3 主要儀器 倒置生物顯微鏡(徠卡儀器有限公司，DMi1)；全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司，Varioskan5250040)；微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐儀器有限公司，ST60-4)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 細(xì)胞培養(yǎng)選用DMEM高糖培養(yǎng)基加1%雙抗和10%FBS，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，換液傳代至細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)穩(wěn)定，在細(xì)胞對數(shù)生長期使用0.25%胰酶進(jìn)行消化，并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按9×104個(gè)/mL的濃度接種到96孔板、6孔板、75 cm2培養(yǎng)瓶中用于后續(xù)試驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為6個(gè)組：對照組(Control group)、模型組(OGD/R group)、陽性組(EDA group)和Rb3組(Rb3 group)。

1.2.2 細(xì)胞OGD/R模型的建立 Na2S2O4是一種氧清除劑，可有效清除細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中的氧，且不會(huì)損傷細(xì)胞膜。因此，本試驗(yàn)選用Na2S2O4來建立神經(jīng)細(xì)胞OGD/R模型，模擬CIRI的病理過程。EDA是一種有效的自由基清除劑，分子量小，易于通過血腦屏障，并且研究證實(shí)其對腦缺血有一定的保護(hù)作用[11]，因此本試驗(yàn)選用100 μmol/L EDA作為陽性對照。對照組細(xì)胞不做任何處理；模型組細(xì)胞用含10 mmol/L Na2S2O4合并無糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行氧糖剝奪培養(yǎng)2 h，繼而恢復(fù)為無血清高糖DMEM培養(yǎng)2 h做復(fù)糖復(fù)氧處理，以建立體外OGD/R模型；陽性組和Rb3組從氧糖剝奪前24 h開始即加入相應(yīng)終濃度的藥物，一直持續(xù)到復(fù)糖復(fù)氧結(jié)束，隨后用倒置生物顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞存活率 首先，確定Rb3的安全濃度范圍。用DMEM完全培養(yǎng)基將Rb3母液稀釋成5、10、20、40、80、160、320、640 μmol/L和1 280 μmol/L，與細(xì)胞共孵育24 h，避光加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，吸出上清，每孔分別加入150 μL DMSO，置于微孔板恒溫振蕩器振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔OD值以檢測細(xì)胞存活率。選擇合適濃度的Rb3(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L和40 μmol/L)進(jìn)行OGD/R試驗(yàn)，各組細(xì)胞在復(fù)糖復(fù)氧2 h后，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，最終確定Rb3的最佳濃度，并按此濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 LDH檢測細(xì)胞死亡率 細(xì)胞接種條件、分組不變，使用96孔板操作。復(fù)糖復(fù)氧2 h后更換無血清培養(yǎng)基，200 μL/孔，按照LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，檢測細(xì)胞死亡率。

1.2.5 熒光探針DCFH-DA檢測ROS 細(xì)胞接種條件、分組不變，使用6孔板操作。復(fù)糖復(fù)氧2 h后采用原位裝載探針法檢測ROS，按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行具體操作。

1.2.6 NO、MDA、SOD、GSH-Px的檢測 細(xì)胞接種條件、分組不變，使用75 cm2培養(yǎng)瓶操作。復(fù)糖復(fù)氧2 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照NO測定試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，測定NO釋放水平。隨后在培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化3 min，用5 mL無血清培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞至15 mL離心管，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL裂解液(冰上裂解30 min)，裂解完全后4 ℃、10 000 r/min離心10 min。吸出上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組細(xì)胞蛋白濃度，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，測定MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.7 Cyt-C的檢測 細(xì)胞接種條件、分組不變，使用75 cm2培養(yǎng)瓶操作。取裂解后的細(xì)胞上清液，按照小鼠Cyt-C酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，檢測細(xì)胞內(nèi)Cyt-C含量。

2 結(jié)果

2.1 HT22細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 對照組細(xì)胞形態(tài)完整呈三角形，有兩極或多極突起，胞體較大，細(xì)胞膜完整光滑，并且連接成網(wǎng)絡(luò)狀；經(jīng)OGD/R處理24 h后，模型組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞失去突起，呈圓形；但Rb3預(yù)處理可以明顯改善這一情況，見圖1。

圖1 各組HT22細(xì)胞形態(tài)(400×)

2.2 Rb3對HT22細(xì)胞安全性的測定 以不同濃度的Rb3處理HT22細(xì)胞24 h，檢測Rb3對細(xì)胞增殖活力的影響。與對照組相比，Rb3給藥濃度在5～160 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率會(huì)隨著給藥濃度的升高而增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Rb3給藥濃度達(dá)到320 μmol/L后，細(xì)胞存活率明顯下降并產(chǎn)生毒性作用，且隨著給藥濃度的升高細(xì)胞存活率逐漸降低，差異極顯著(P<0.01)，見圖2。

圖2 Rb3對HT22細(xì)胞增殖活力的影響

2.3 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞的細(xì)胞存活率和死亡率的影響 MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯下降，達(dá)到半數(shù)致死，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，Rb3組細(xì)胞存活率增加，當(dāng)Rb3給藥濃度在2.5～10 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率的增長呈現(xiàn)劑量依賴性，在20～40 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率逐漸下降，得出Rb3最佳有效濃度為2.5、5 μmol/L和10 μmol/L，并以這些濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。LDH釋放是檢測細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞死亡率檢測。LDH檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，Rb3 10 μmol/L給藥及陽性藥EDA明顯抑制了LDH釋放量，使細(xì)胞的死亡率降低(P<0.05或P<0.01)；而Rb3 2.5 μmol/L和5 μmol/L給藥細(xì)胞死亡率有降低趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞的細(xì)胞存活率(A)和死亡率(B)的影響

2.4 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞的氧化水平的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組NO、ROS和MDA的含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，Rb3以及陽性藥物EDA能明顯降低NO、ROS和MDA的含量，且Rb3作用呈現(xiàn)劑量依賴性，Rb3 10 μmol/L給藥時(shí)差異極顯著(P<0.01)，見圖4。

圖4 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞的NO釋放水平(A)、ROS熒光水平(B)和MDA含量(C)的影響

2.5 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞抗氧化水平的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組SOD、GSH-Px的含量明顯受到抑制，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，陽性組能極顯著提高細(xì)胞中SOD的含量(P<0.01)，顯著提高細(xì)胞中GSH-Px的含量(P<0.05)；與模型組相比，Rb3 5 μmol/L組和10 μmol/L組的SOD含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)，Rb3 2.5 μmol/L組的SOD含量有升高趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)，Rb3組GSH-Px的含量明顯升高，并呈劑量依賴性，差異極顯著(P<0.01)，見圖5。

圖5 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞抗氧化酶SOD(A)和GSH-Px(B)水平的影響

2.6 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Cyt-C濃度水平的影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組Cyt-C的含量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，Rb3組和陽性組均能顯著抑制細(xì)胞中Cyt-C的釋放，差異極顯著(P<0.01)，且Rb3 5 μmol/L效果最佳，見圖6。

圖6 Rb3對OGD/R損傷HT22細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Cyt-C濃度的影響

3 討論

腦缺血和再灌注引起的線粒體損傷導(dǎo)致ROS大量的爆發(fā)，機(jī)體對于超氧化物清除能力降低以及超氧化物積累的增加[12]，引起脂質(zhì)過氧化作用，這是缺血性腦卒中的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)之一[13]。由于海馬椎體神經(jīng)元HT22是海馬區(qū)的主要成分，對缺血缺氧最敏感，是臨床上神經(jīng)系統(tǒng)疾病最易受累的部位[14]。在試驗(yàn)研究中HT22常用于探討抗CIRI及抗調(diào)亡的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制[15]。因此，本試驗(yàn)從氧化應(yīng)激這一病理環(huán)節(jié)出發(fā)，采用HT22建立體外模型，模擬機(jī)體缺血-再灌注損傷的過程。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在光學(xué)顯微鏡下觀察到OGD/R可導(dǎo)致HT22細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、聚集現(xiàn)象，胞質(zhì)凝縮為圓形，細(xì)胞突觸消失；而對照組細(xì)胞呈梭形且相互連接成網(wǎng)絡(luò)，與之前的報(bào)道一致[16]；但Rb3預(yù)處理可以減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的病理改變，增加細(xì)胞活力并減少細(xì)胞死亡率，起到神經(jīng)保護(hù)作用，且作用效果呈濃度依賴性。目前研究發(fā)現(xiàn)，再灌注期間所帶入的氧生成了大量的ROS，由于細(xì)胞不能及時(shí)清除，導(dǎo)致了ROS攻擊生物膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物MDA，從而引起細(xì)胞毒性反應(yīng)[12]。此外，再灌注后ROS也可促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶生成，由此產(chǎn)生的NO在ROS的催化作用下生成過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，也會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而加重再灌注損傷[17]。因此，檢測ROS和NO可以反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度和神經(jīng)細(xì)胞損傷程度。但GSH-Px與SOD同是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶，具有極強(qiáng)的還原作用，負(fù)責(zé)清除過氧化物，調(diào)節(jié)氧化平衡，可發(fā)揮抗CIRI作用[18]。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Rb3組均能抑制OGD/R模型中ROS、NO水平的釋放，并且通過調(diào)節(jié)提高細(xì)胞的抗氧化酶SOD、GSH活性以及減少氧化產(chǎn)物MDA的含量水平，減少自由基的產(chǎn)生，阻止進(jìn)一步的細(xì)胞死亡，從而抵抗氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是I/R腦損傷的最終和主要決定因素，抑制細(xì)胞凋亡是缺血性腦卒中治療的關(guān)鍵步驟[19]。近年來，人參皂苷Rb3對缺氧缺血性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用已得到證實(shí)[20-21]。Zhu等[16]報(bào)道人參皂苷Rb3通過抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高、細(xì)胞Caspase活性和凋亡，對OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞缺血損傷有明顯的保護(hù)作用。Jiang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3通過抑制NMDA和AMPA受體，可有效減少OGD期間細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，起到抗凋亡的作用。而在激活細(xì)胞凋亡的途徑中，目前研究顯示，線粒體Cyt-C作為內(nèi)源性途徑，在凋亡過程中發(fā)揮主要作用[23]。腦缺血再灌注后線粒體內(nèi)Ca2+水平的增加會(huì)觸發(fā)ROS的過度產(chǎn)生，并傳遞凋亡信號(hào)，使Cyt-C等促凋亡蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，然后Cyt-C與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合，進(jìn)一步激活效應(yīng)因子Caspase-3，誘發(fā)凋亡的發(fā)生，最終致神經(jīng)元死亡[24]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Rb3可以明顯抑制Cyt-C的釋放。綜上，Rb3能夠?qū)筄GD/R誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷，可能通過增加抗氧化酶活性和減少氧化產(chǎn)物來減輕氧化應(yīng)激損傷，并且抑制Cyt-C的釋放以減少內(nèi)源性凋亡，從而提高細(xì)胞存活率，共同發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果提示人參皂苷Rb3對治療CIRI有良好的前景，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。