薏苡仁水提液對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)機(jī)制

張 濤，周期律，余儒洋，鐘 佳，劉鐘杰，胡宇聲

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 昌平 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

非特異性結(jié)腸炎是小動(dòng)物臨床的常見(jiàn)疾病，屬于炎性腸病的范疇。非特異性結(jié)腸炎以反復(fù)發(fā)作的消化道癥狀為特征，極易引發(fā)貧血、感染和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，嚴(yán)重影響動(dòng)物的壽命和生存質(zhì)量。現(xiàn)有的研究認(rèn)為，腸黏膜固有層中免疫細(xì)胞數(shù)量異常是導(dǎo)致非特異性結(jié)腸炎發(fā)病的重要原因之一[1]。腸道固有層中的免疫細(xì)胞是維持機(jī)體免疫力的基礎(chǔ)，當(dāng)固有層內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量異常時(shí)，會(huì)引發(fā)局部免疫抑制或亢進(jìn)，進(jìn)而誘發(fā)結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)[2]?，F(xiàn)有針對(duì)非特異性結(jié)腸炎的治療以抗炎藥為主，但副作用較為明顯。在中獸醫(yī)視角下，非特異性結(jié)腸炎動(dòng)物的臨床表現(xiàn)往往體現(xiàn)出濕邪致病的特征，故中獸醫(yī)以祛濕健脾為主的療法在臨床中療效較好。薏苡仁作為健脾化濕藥，是治療非特異性結(jié)腸炎的常用中藥。含有薏苡仁的方劑或其成分的藥物在臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室研究中均被證實(shí)可緩解結(jié)腸炎癥狀[3-4]。然而，針對(duì)薏苡仁單一藥物對(duì)結(jié)腸炎作用的研究目前少見(jiàn)報(bào)道，其發(fā)揮相應(yīng)作用的機(jī)制亦尚不明確。

葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium,DSS)溶液中帶負(fù)電荷的硫酸基對(duì)腸上皮細(xì)胞具有毒性，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)與非特異性結(jié)腸炎相似的臨床表現(xiàn)和病理變化，因而自由飲用DSS溶液所誘導(dǎo)的試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型已成為最常用的研究非特異性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型之一[5]。本試驗(yàn)通過(guò)DSS自由飲用方式制備小鼠試驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，以疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index,DAI)、血清氧化指標(biāo)和結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分評(píng)估薏苡仁水提液(Coix seed decoction,CSD)對(duì)結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用，并通過(guò)結(jié)腸黏膜中T細(xì)胞亞群和固有免疫細(xì)胞數(shù)量的變化，探究CSD可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡昆明小鼠，雌性，體重(35±2)g，清潔級(jí)，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；糞便潛血檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自廣東珠海貝索有限公司；CD3 FITC、CD8a PE、CD45 PerCP-cy5.5、CD4 APC、CD11b PE、LY-6G PE-Cy7、F4-80 APC、CD11c FITC、CD45 PerCP-Cy5.5抗體，均購(gòu)自BioLegend(美國(guó))；DSS，購(gòu)自北京Coolaber科技有限公司；薏苡仁，購(gòu)自北京同仁堂藥店。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀(LSRII型，Becton,Dickinson and Company，美國(guó))；低速離心機(jī)(京立離心機(jī)有限公司，中國(guó))。

1.4 薏苡仁水提液的制備 取8 g薏苡仁于室溫條件下在雙蒸水中經(jīng)過(guò)浸泡、熬制、定容、加壓過(guò)濾等步驟，獲得的200 mL澄清液體即為4%(w/v)CSD，將4% CSD使用3倍體積無(wú)菌雙蒸水稀釋，即獲得1%(w/v)CSD。將制備完成的水提液分裝存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中，并于使用前水浴復(fù)溫至40 ℃。

1.5 試驗(yàn)分組及處理 將32只小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組：空白對(duì)照(CON)組，模型(DSS)組，高、低濃度薏苡仁水提液(HCSD、LCSD)組。小鼠以組為單位，始終飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度55%±10%，晝夜節(jié)律為12 h-12 h的環(huán)境中。本試驗(yàn)所涉及的動(dòng)物試驗(yàn)均獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)(AW15012020-3)。動(dòng)物試驗(yàn)共進(jìn)行20 d，前10天為預(yù)保護(hù)期，HCSD組小鼠每日灌胃4% CSD 1 mL/(50 g·bw)，LCSD組小鼠每日灌胃1% CSD 1 mL/(50 g·bw)，CON組和DSS組小鼠每日灌胃生理鹽水1 mL/(50 g·bw)，各組小鼠在預(yù)保護(hù)期飲用水均為純凈水；后10天為造模期，在維持預(yù)保護(hù)期用藥方式的基礎(chǔ)上，分別在第11、12、15、16、19天和第20天更換DSS組、LCSD組和HCSD組小鼠飲用水為5%(w/v)DSS，對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)性結(jié)腸炎造模，第13、14、17天和第18天為間歇期，更換此3組小鼠飲用水為純凈水，CON組小鼠在造模期飲用水均為純凈水。在第13、17天和第21天進(jìn)行DAI評(píng)分，從糞便黏稠度、糞便潛血、體重變化3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，總得分即3項(xiàng)評(píng)分總和，評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表1。在第21天眼球采血收集小鼠血清后，處死小鼠。每組隨機(jī)挑選4只小鼠于結(jié)腸中段取3 cm左右結(jié)腸組織，沖洗后保存于預(yù)冷的 PBS 溶液中，另4只小鼠將腸段沖洗后保存于4%多聚甲醛中，備用。

表1 DAI評(píng)分細(xì)則

1.6 組織病理學(xué)評(píng)分 將1.5中所取腸段分別經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色等步驟完成切片制作，并于顯微鏡下觀察，組織病理學(xué)評(píng)分由實(shí)驗(yàn)人員從炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、皺襞萎縮程度、水腫程度3個(gè)方面進(jìn)行盲法評(píng)價(jià)，每個(gè)指標(biāo)按嚴(yán)重程度分別劃分為0～3分。

1.7 血清氧化指標(biāo)含量的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)收集血清中SOD活力和MDA含量。

1.8 流式染色檢測(cè) 將1.5中所取結(jié)腸組織經(jīng)剪碎、消化、洗滌、離心、過(guò)濾、重懸等步驟后，保存在4 ℃環(huán)境中，使用CD3 FITC、CD8a PE、CD4 APC、CD11b PE、Ly-6G PE-Cy7、F4-80 PerCP-Cy5.5、CD11c FITC、CD45 BV421抗體分別對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均在SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠DAI的影響 由圖1可知，與CON組相比，DSS組、LCSD組和HCSD組小鼠在造模過(guò)程中DAI均出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)；與DSS組相比，LCSD組小鼠第17天DAI評(píng)分未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)LCSD組和HCSD組小鼠DAI評(píng)分均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)。

圖1 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠DAI的影響(n=8)

2.2 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響 由圖2可知，與CON組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，組織疏松水腫，皺襞萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血，上皮細(xì)胞脫落；而HCSD組和LCSD組受到CSD保護(hù)后結(jié)腸組織學(xué)形態(tài)明顯改善。對(duì)各組H.E.染色切片進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)與CON組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著增加(P<0.05)；與DSS組相比，HCSD組和LCSD組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

圖2 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響(n=4)

2.3 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠機(jī)體氧化損傷的影響 由圖3可知，與CON組相比，DSS組小鼠血清中SOD活力顯著下降(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)，而與DSS組和CON組相比，LCSD組和HCSD組小鼠血清中SOD活力顯著上升(P<0.05)，MDA含量則顯著下降(P<0.05)。

圖3 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠血清氧化指標(biāo)的影響(n=8)

2.4 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中T淋巴細(xì)胞亞群分布的影響 由圖4可知，與CON組相比，DSS組結(jié)腸組織中CD4+T淋巴細(xì)胞占比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；而與CON組和DSS組相比，LCSD組和HCSD組結(jié)腸組織中CD4+T淋巴細(xì)胞占比顯著增高(P<0.05)；各組之間CD8+T淋巴細(xì)胞占比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖4 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中T淋巴細(xì)胞亞群分布的影響(n=4)

2.5 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中免疫細(xì)胞的影響 由圖5可知，與CON組相比，DSS組小鼠結(jié)腸組織中樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的含量均顯著降低(P<0.05)；與DSS組相比，LCSD組和HCSD組小鼠結(jié)腸組織中樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的含量均顯著升高(P<0.05)，而與CON組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖5 CSD對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中固有免疫細(xì)胞的影響(n=4)

3 討論

在本試驗(yàn)中，造模組小鼠的DAI和組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果表明試驗(yàn)性結(jié)腸炎造模成功，結(jié)腸組織形態(tài)變化與之前的報(bào)道相一致[6]。DAI結(jié)果亦表明，CSD對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的腹瀉、體重減輕、糞便隱血等典型癥狀具有緩解作用。為進(jìn)一步明確CSD對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸炎發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制，本試驗(yàn)分析了與結(jié)腸炎癥密切相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)[7]。機(jī)體抗氧化與促氧化之間失衡且傾向于促氧化就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，隨之而來(lái)的氧化損傷被認(rèn)為是炎癥損傷機(jī)體的重要原因之一[8]。SOD是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一類抗氧化酶，能夠催化超氧化陰離子降解，從而起到減輕氧化損傷的作用[7]。MDA則是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，能夠引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)，其含量能直接反映氧化損傷的程度[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠血清內(nèi)SOD活力降低、MDA含量升高，而CSD可以抑制該現(xiàn)象的出現(xiàn)，表明試驗(yàn)性結(jié)腸炎造成了小鼠全身性的氧化應(yīng)激，但CSD可顯著增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗氧化能力。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，薏苡仁作為一種常見(jiàn)谷物，含有豐富的不飽和脂肪酸[9]。而不飽和脂肪酸中的雙鍵具有強(qiáng)大的還原性，可還原組織中的ROS以達(dá)到抗氧化的目的[10]。同時(shí)，薏苡仁內(nèi)含有的薏苡素、薏苡仁酯也已被證實(shí)具有顯著的抗氧化能力[11]。綜上所述，CSD對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠具有保護(hù)作用，該作用與CSD的抗氧化能力有一定關(guān)系。

免疫反應(yīng)本質(zhì)上是機(jī)體清除異物，修復(fù)自身組織的過(guò)程，對(duì)機(jī)體是有益的。當(dāng)免疫反應(yīng)失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致組織過(guò)度損傷。因此，如何利用藥物保證機(jī)體免疫反應(yīng)處于正常有序的狀態(tài)是治療的關(guān)鍵之一[12]。臨床研究表明，非特異性結(jié)腸炎的發(fā)病與腸道免疫紊亂尤其是T淋巴細(xì)胞亞群分布變化有密切聯(lián)系[13]。在慢性結(jié)腸炎病例中，患者結(jié)腸組織內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)量相比正常人均出現(xiàn)下降[14]。作為一類可以同時(shí)調(diào)控先天性免疫和獲得性免疫的細(xì)胞，組織內(nèi)成熟的T淋巴細(xì)胞含量降低提示組織出現(xiàn)免疫功能障礙，進(jìn)而破壞組織穩(wěn)態(tài)并造成炎癥的發(fā)生[14]。因此本試驗(yàn)使用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠結(jié)腸組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群分布，結(jié)果顯示，DSS組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)量與CON組無(wú)顯著性差異，但結(jié)腸組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，DSS組小鼠結(jié)腸黏膜有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。分析其原因，可能是DSS組小鼠在造模過(guò)程中雖然出現(xiàn)炎性反應(yīng)引發(fā)了淋巴細(xì)胞募集過(guò)程，但組織內(nèi)的T淋巴細(xì)胞并未被激活分化并發(fā)揮作用。但在本試驗(yàn)中，LCSD組和HCSD組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞含量顯著上升，證明CSD可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞成熟，從而增強(qiáng)小鼠結(jié)腸免疫功能。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，由于炎性因子的分泌以及組織固有免疫細(xì)胞的介導(dǎo)，T淋巴細(xì)胞被募集并激活分化，從而調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)并抵抗外界病原入侵[14]。然而在本試驗(yàn)中DSS組小鼠在造模過(guò)程中T淋巴細(xì)胞并未分化，暗示DSS組小鼠可能存在免疫抑制過(guò)程，本課題組將進(jìn)一步探索其中的機(jī)理。

在組織炎性反應(yīng)過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞是具有重要作用的固有免疫細(xì)胞，其數(shù)量可以直接反映固有免疫力的強(qiáng)弱[15]。樹(shù)突狀細(xì)胞是常見(jiàn)的抗原呈遞細(xì)胞，其對(duì)T淋巴細(xì)胞具有顯著的激活作用。在本試驗(yàn)中，DSS組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)成熟的T淋巴細(xì)胞含量降低可能與樹(shù)突狀細(xì)胞比例顯著下降有關(guān)，同時(shí)也證實(shí)DSS組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)存在免疫抑制過(guò)程。而CSD維持了樹(shù)突狀細(xì)胞含量，從而保證了T淋巴細(xì)胞激活。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的分泌作用，近期研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞除常規(guī)促炎作用外，也具有強(qiáng)大的抑炎作用，可以顯著降低組織甚至機(jī)體的氧化水平[16]。另外，巨噬細(xì)胞的吞噬作用也可以協(xié)助組織清除病原，從而恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)。由此可以推測(cè)，DSS組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)巨噬細(xì)胞含量顯著降低，從而不能很好的清除抗原、恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)存在的病原可能是刺激結(jié)腸炎癥進(jìn)一步加重并導(dǎo)致全身性氧化應(yīng)激的關(guān)鍵。但是CSD可維持小鼠正常巨噬細(xì)胞功能，從而保證免疫系統(tǒng)的正常工作，并發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明薏苡仁水提液可以緩解小鼠試驗(yàn)性結(jié)腸炎癥狀，該作用可能與其調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分布、維持固有免疫細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用有關(guān)。