ELISA抗體檢測(cè)試劑盒與病毒中和試驗(yàn)對(duì)臨床牛血清樣本中牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒抗體的檢測(cè)比對(duì)

朱 真，李 靜，張 蕾，董春娜，李鵬宇，杜吉革，石守定，肖 進(jìn)，陳小云

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京 海淀 100095；3.中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)，北京 西城 100044)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)是由痘病毒科羊痘病毒屬的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的急性傳染性疾病，該病可感染任何年齡階段、任何品種的牛，引起廣泛的皮膚病變和典型的全身型痘病毒感染癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，其中犢牛死亡率可達(dá)100%，成年牛的死亡率在3%～10%，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)列為必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病[1]，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。

2019年8月12日，經(jīng)中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心確診，新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州發(fā)生LSD疫情，這是我國(guó)首次確診該病[2]。2020年6月5日—7月12日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報(bào)了6起LSD疫情[3]。我國(guó)鄰國(guó)俄羅斯、泰國(guó)等國(guó)家時(shí)常發(fā)生LSD疫情，給我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅[4]。目前，LSD已在我國(guó)多地呈逐漸流行趨勢(shì)，嚴(yán)重危害我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)。

本研究使用中牧實(shí)業(yè)股份有限公司制備的3批牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品對(duì)臨床采集的260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清進(jìn)行檢測(cè)，并與病毒中和試驗(yàn)(Virus neutralization test,VNT)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以期為L(zhǎng)SDV抗體水平檢測(cè)提供合理的檢測(cè)手段，為免疫程序的制定以及疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)試劑盒 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，采用LSDV多種免疫優(yōu)勢(shì)抗原肽作為包被抗原，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司制備，試劑盒批號(hào)分別為L(zhǎng)SDV-1、LSDV-2和LSDV-3。

1.1.2 待檢血清 共460份血清，均經(jīng)65 ℃30 min滅活后，從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(The biological safety level-3 laboratory,BSL-3)移出。按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《牛結(jié)節(jié)性皮膚病診斷技術(shù)》(GB/T 39602—2020)[5]中規(guī)定的PCR方法，對(duì)460份血清進(jìn)行PCR檢測(cè)，均為L(zhǎng)SDV抗原陰性，可用于ELISA抗體檢測(cè)。

1.1.2.1 感染牛血清 260份，編號(hào)I 1～I(xiàn) 260，為L(zhǎng)SDV臨床發(fā)病牛血清，采自吉林、山東、河北等疫區(qū)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2.2 健康牛血清 200份，編號(hào)Y 1～Y 200，采集自臨床未免疫山羊痘活疫苗且牛結(jié)節(jié)性皮膚病抗原檢測(cè)為陰性的健康牛，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供。

1.1.3 細(xì)胞 山羊睪丸原代細(xì)胞，F(xiàn)4代，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.1.4 病毒 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LSDV ZJS01株)，F(xiàn)2代細(xì)胞毒，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和保存。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法 以LSDV多種免疫優(yōu)勢(shì)抗原肽作為包被抗原，建立間接ELISA方法。(1)在血清稀釋板中將待檢血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋，陰性和陽(yáng)性對(duì)照血清已稀釋，可直接使用。(2)取抗原包被板，將稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清加入到抗原包被板中，100 μL/孔。每份待檢血清設(shè)1孔，陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清各設(shè)2孔，加樣過(guò)程時(shí)間跨度應(yīng)盡量短。振蕩混勻(勿溢出)，置37 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min。(3)棄去反應(yīng)液，每孔加入洗滌液300 μL，連續(xù)洗板5次后拍干。(4)各孔加入已稀釋至工作濃度的HRP-抗牛IgG 100 μL，置37 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min。(5)棄去反應(yīng)液，每孔加入洗滌液300 μL，連續(xù)洗板5次后拍干。(6)每孔加入100 μL底物工作液(將底物液A和底物液B等量混合即為底物工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配)，振蕩混勻，置37 ℃溫箱內(nèi)避光反應(yīng)15 min。(7)各孔加入顯色終止液50 μL，振蕩混勻終止反應(yīng)，15 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。(8)試驗(yàn)成立的條件：陽(yáng)性對(duì)照孔OD450 nm值應(yīng)介于1.0～2.2，陰性對(duì)照孔OD450 nm值均應(yīng)≤0.15。(9)判定標(biāo)準(zhǔn)：臨界值(Cut-off值)=陽(yáng)性對(duì)照孔OD450 nm均值×0.15；待檢血清測(cè)定OD450 nm值≥臨界值者判為陽(yáng)性；待檢血清測(cè)定OD450 nm值<臨界值者判為陰性。

1.2.2 VNT方法 于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所ABSL-3實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展VNT檢測(cè)。(1)對(duì)于260份LSDV感染牛血清，用MEM細(xì)胞生長(zhǎng)液將待檢血清進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，從1∶2至1∶256，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，每孔125 μL。(2)對(duì)于200份健康牛血清，用MEM細(xì)胞生長(zhǎng)液將待檢血清進(jìn)行1∶2稀釋，重復(fù)2孔，每孔125 μL。(3)用MEM細(xì)胞生長(zhǎng)液將已測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(Tissue culture infective dose,TCID50)的LSDV病毒液稀釋為200 TCID50/0.1 mL，將稀釋好的病毒液加入到血清稀釋孔中，每孔125 μL，置37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中作用1 h。(4)將中和后的血清—病毒混合液接種于已長(zhǎng)成良好單層山羊睪丸原代細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，每孔0.2 mL，置37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)陰性血清對(duì)照、病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。(5)每日觀察記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)情況，直至細(xì)胞穩(wěn)定，一般需96～120 h，按Reed-Muench法計(jì)算被檢血清中病毒中和抗體效價(jià)[6]。

2 結(jié)果

2.1 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 3批牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，3批牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的陰陽(yáng)性判定結(jié)果一致。對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)敏感性為86.9%(226/260)，對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)特異性為100%(200/200)。

表1 LSDV感染牛血清和健康牛血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2 VNT檢測(cè) 對(duì)260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2和表3，VNT方法對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)敏感性為81.9%(213/260)，對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)特異性為100%(200/200)。

表2 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT檢測(cè)結(jié)果

表3 LSDV感染牛血清和健康牛血清的VNT檢測(cè)結(jié)果匯總

2.3 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒與VNT的檢測(cè)符合率 2種方法對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的為201份，均為陰性的為22份，檢測(cè)符合率為85.8%(223/260)，見(jiàn)表4。2種方法對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)符合率為100%(200/200)，見(jiàn)表5。

表4 ELISA與VNT檢測(cè)LSDV感染牛血清的符合率

表5 ELISA與VNT檢測(cè)健康牛血清的符合率

3 討論

LSD是一種病毒性傳染病，與我國(guó)接壤的蒙古、老撾、馬來(lái)西亞、柬埔寨、斯里蘭卡和泰國(guó)等國(guó)家一直有LSD疫情發(fā)生[7-12]，我國(guó)于2019年8月12日首次確診LSD疫情[2]，隨后我國(guó)多省均發(fā)生LSD疫情[13]。該病主要發(fā)生于吸血蟲(chóng)媒活躍的季節(jié)，多通過(guò)吸血昆蟲(chóng)(蚊、蠅、蠓、虻、蜱等)叮咬傳播[14]。該病的傳播和流行給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，可造成病牛消瘦、產(chǎn)奶量急劇下降、皮膚結(jié)節(jié)處出現(xiàn)凹陷或空洞，使其經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低。結(jié)合LSDV依靠吸血蟲(chóng)媒叮咬傳播的特性、頻繁的動(dòng)物貿(mào)易以及鄰國(guó)之間的染疫動(dòng)物的遷徙，將進(jìn)一步增加LSD的防控難度，我國(guó)短期內(nèi)不會(huì)根除LSD[15-16]。

目前我國(guó)對(duì)于LSD的防控措施主要是撲殺。省級(jí)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部門(mén)可根據(jù)轄區(qū)內(nèi)動(dòng)物疫病流行情況，對(duì)牛結(jié)節(jié)性皮膚病實(shí)施強(qiáng)制免疫[14]。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有LSD疫苗，根據(jù)《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》[14]要求，對(duì)疫情危險(xiǎn)區(qū)縣采取山羊痘活疫苗免疫(按山羊5倍劑量)。因此建立一種快速、準(zhǔn)確的抗體水平檢測(cè)方法對(duì)免疫程序的制定以及疫病防控具有重要的意義。

OIE推薦的用于LSD的血清學(xué)診斷方法包括VNT、ELISA、間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect fluorescence antibody test,IFAT)、免疫印跡試驗(yàn)(Western blot,WB)等[17]。VNT是血清學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于VNT試驗(yàn)中需要接觸LSDV活病毒，必須在有資質(zhì)的 BSL-3實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)，且對(duì)試驗(yàn)操作要求較高，不適于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)大量血清的檢測(cè)。IFAT方法也需要接觸LSDV活病毒，必須在BSL-3實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展試驗(yàn)。有研究表明，IFAT方法檢測(cè)LSDV血清抗體特異性略差，易與羊口瘡病毒等發(fā)生交叉反應(yīng)，而且結(jié)果判定較為主觀[18-19]。WB用于檢測(cè)LSDV的P32抗原，具有很好的敏感性和特異性，但由于其操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[20]。ELISA方法是市場(chǎng)上主流的免疫測(cè)定技術(shù)，具有敏感性好、特異性高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

本研究采用的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研制，該ELISA方法為基于LSDV多種免疫優(yōu)勢(shì)抗原的合成肽作為包被抗原建立的間接ELISA方法，以合成肽抗原作為包被抗原具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)合成肽抗原為人工化學(xué)合成的多肽，合成中不需要接觸和使用活病毒，不存在生物安全隱患；(2)多肽抗原為針對(duì)特定抗原位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，與相應(yīng)抗體的結(jié)合力強(qiáng)；(3)多種優(yōu)勢(shì)抗原肽混合包被，大大增加了試劑盒檢測(cè)的敏感性。為了驗(yàn)證牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒與VNT檢測(cè)方法之間的符合率，本研究采用3批ELISA試劑盒與VNT方法，同時(shí)對(duì)260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。結(jié)果顯示，3批結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)260份LSDV感染牛血清和200份健康牛血清的陰陽(yáng)性判定結(jié)果一致，對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)敏感性為86.9%(226/260)，對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)特異性為100%(200/200)。VNT方法對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)敏感性為81.9%(213/260)，對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)特異性為100%(200/200)。牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒與VNT方法對(duì)260份LSDV感染牛血清的檢測(cè)符合率為85.8%(223/260)，對(duì)200份健康牛血清的檢測(cè)符合率為100%(200/200)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室研制的牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒敏感性高、特異性好，可用于LSD抗體檢測(cè)。