喜馬拉雅旱獺骨骼肌低氧適應的組織學特點

秦鴻楠，周 娟，李 琳，張勤文

(青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016)

喜馬拉雅旱獺(Himalayan marmot)屬嚙齒動物，主要分布在我國西藏、甘肅、青海等地區(qū)。棲息于海拔2 500～5 200 m的高山草甸草原、高山草原等環(huán)境中[1-2]。旱獺為了適應這種高原低氧環(huán)境，其形態(tài)學和生理學都發(fā)生了一定的適應性變化。研究發(fā)現(xiàn)，處于不同海拔高度的喜馬拉雅旱獺，其心肌肌纖維都出現(xiàn)不同程度的紊亂和肌節(jié)模糊的現(xiàn)象[3-4]。馬嵋等[5]研究表明，新疆灰旱獺右心室肥厚指數(shù)、纖維化程度均高于SD大鼠。喜馬拉雅旱獺的紅細胞(Red blood cell,RBC)、紅細胞比容(Hematocrit value,HCT)和血紅蛋白含量隨海拔增加逐漸增加，從而提高氧氣的利用率[4]。賈榮莉[6]研究發(fā)現(xiàn)，喜馬拉雅旱獺具有肺泡中毛細血管豐富、支氣管上皮存在杯狀細胞等特點。

骨骼肌是哺乳動物軀體運動的物質(zhì)基礎。對于肌肉組織學特性的研究表明，可以根據(jù)肌纖維直徑和肌纖維表面積密度來判定肌肉品質(zhì)，肌纖維直徑越小，肉質(zhì)越好；影響肌纖維粗細的因素有很多，如品種、營養(yǎng)狀況和年齡等[7-8]。在有關高原牦牛的研究中發(fā)現(xiàn)，與平原黃牛相比，大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑細，而表面積密度大[9]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高，大通牦牛骨骼肌肌纖維直徑隨著年齡的增長逐漸增大，肌纖維表面積密度也隨之增加[10]。葉于聰?shù)萚11]研究表明，急進高原大鼠的心肌細胞的超微結(jié)構發(fā)生變化，線粒體變形腫脹，基質(zhì)密度下降，嵴出現(xiàn)不同程度的溶解或缺損等；因低氧引起急進大鼠心肌線粒體變形，使心肌細胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)合成減少，能量代謝受到影響，從而引起細胞內(nèi)外水腫甚至造成心肌細胞壞死，而旱獺心肌細胞超微結(jié)構正常，表明喜馬拉雅旱獺對高原低氧環(huán)境有良好的適應性。目前對于旱獺骨骼肌低氧適應的組織學特點報道較少，因此本試驗以喜馬拉雅旱獺為研究對象，以SD大鼠為對照，采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色、免疫組織化學和電鏡技術，對旱獺骨骼肌的組織學特點進行觀測和分析，探討旱獺骨骼肌組織低氧適應的組織學特點，旨在闡明旱獺骨骼肌的組織學特點和對高原低氧環(huán)境適應的特點，進一步為高原醫(yī)學研究提供理論依據(jù)，并為高原獸醫(yī)研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)多克隆抗體、CD34多克隆抗體、檸檬酸鹽緩沖液和DAB顯色劑，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清，購自北京科瑞泰科技有限公司。

1.2 主要儀器 脫水機(Donatello)，購自DIAPATH公司；包埋機(JB-P5)和凍臺(JB-L5)，均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)和超薄切片機(LKB-2188)，均購自上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(KD-P)，購自浙江金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱(DHG-9140A)，購自上?；厶﹥x器制造有限公司；脫色搖床(TSY-B)、渦旋混合器(MX-F)和組化筆(WG1066-1)，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；正置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse C1)、透射電鏡(JEM-2000EX)和成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)，均購自日本尼康公司。

1.3 動物和處理 選取青海省地方病預防控制所飼養(yǎng)的成年喜馬拉雅旱獺5只和SD大鼠5只，臨床健康，不計性別。喜馬拉雅旱獺、SD大鼠均于現(xiàn)場屠宰后立即取其腓腸肌，一部分用4%多聚甲醛固定，用于H.E.染色和免疫組織化學染色；一部分用2.5%戊二醛固定，用于電鏡指標的測定。

1.4 肌纖維直徑和肌纖維表面積密度測量 常規(guī)石蠟切片，H.E.染色。用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)直接測量肌纖維直徑，并按照張勤文等[12]報道的方法測算出肌纖維表面積密度。

1.5 免疫組織化學染色 切片常規(guī)脫蠟至水；PBS沖洗；將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中修復抗原，冷卻至室溫；PBS沖洗，滴加3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性并室溫孵育；PBS沖洗，滴加5%的胎牛血清封閉液，不洗；分別滴加兔抗鼠VEGF和CD34多克隆抗體，4 ℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素化山羊抗兔工作液(1∶200)稀釋；PBS沖洗，滴加試劑SABC室溫孵育；PBS沖洗后DAB顯色劑顯色，待有陽性細胞出現(xiàn)且背景淡時用蒸餾水終止反應；用酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。VEGF陽性表達胞漿著色為棕黃色顆粒，用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)直接測量VEGF在單位面積內(nèi)的陽性表達量，按張勤文等[12]報道的方法測算出單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)量，以陽性表達量/單位面積內(nèi)肌纖維數(shù)量，所得比值作為VEGF在單位面積內(nèi)的陽性表達率。根據(jù)Weidner等[13]校正方法將染色的任一細胞或細胞叢作為一微血管，先在低倍鏡下觀察切片全部視野并確定微血管密度最高區(qū)域，后在高倍鏡下計數(shù)5個視野的微血管數(shù)，取其平均值作為該樣本的微血管密度(Microvascular density,MVD)。

1.6 電鏡指標觀測 將已處理好的樣品制成70 nm超薄切片，切片用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進行雙重染色。在JEM-2000EX透射電鏡下觀察，隨機拍攝并在透射電鏡放大10 000倍后，進行照片掃描入電腦。參照鄭富盛[14]的相關計算方法，采用方格測量系統(tǒng)，測算出線粒體的基本參數(shù)。按立體學公式[15]計算出線粒體的平均截面積(Ax)、平均體積(V)、體積密度(Vv)、面數(shù)密度(NA)等各結(jié)構參數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 通過SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤來表示。以P<0.05作為差異顯著性的標準。

2 結(jié)果

2.1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維表面積密度比較 由表1和圖1～2可知，喜馬拉雅旱獺的肌纖維直徑小于SD大鼠，且差異極顯著(P<0.01)，喜馬拉雅旱獺的肌纖維表面積密度大于SD大鼠，且差異顯著(P<0.05)。

圖1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑(A)和肌纖維表面積密度(B)的比較

表1 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌肌纖維直徑和肌纖維表面積密度的比較

H.E.染色時細胞核呈藍色，肌纖維呈粉紅色。由圖2可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌肌纖維排列致密、規(guī)則且肌纖維較細，SD大鼠骨骼肌肌纖維排列較疏松。

圖2 喜馬拉雅旱獺(A)和SD大鼠(B)骨骼肌的顯微結(jié)構(H.E.染色，400×)

2.2 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD比較 由表2和圖3可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌中VEGF陽性表達率和MVD均高于SD大鼠，且差異均極顯著(P<0.01)。

圖3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD的比較

表2 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌中VEGF和MVD的比較

免疫組化染色中棕黃色即為陽性表達，通過棕黃色的深淺可判斷VEGF的表達量，CD34標記的棕黃色為微血管內(nèi)皮細胞。由圖4可知，喜馬拉雅旱獺VEGF、MVD陽性表達量均高于SD大鼠。

圖4 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌的免疫組化染色(400×)

2.3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度比較 由表3和圖5可知，喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體平均截面積和平均體積均小于SD大鼠且差異極顯著(P<0.01)；喜馬拉雅旱獺骨骼肌細胞線粒體的體積密度和面數(shù)密度均大于SD大鼠且差異極顯著(P<0.01)。

圖5 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度的比較

表3 喜馬拉雅旱獺與SD大鼠骨骼肌細胞線粒體的平均截面積、平均體積、體積密度和面數(shù)密度的比較

由圖6可知，喜馬拉雅旱獺與SD大鼠線粒體結(jié)構均完整規(guī)則，喜馬拉雅旱獺線粒體排列緊湊，SD大鼠線粒體排列疏松；喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體表現(xiàn)出體積小、數(shù)量多的特點。

圖6 喜馬拉雅旱獺(A)與SD大鼠(B)骨骼肌細胞線粒體分布情況(10 000×)

3 討論

骨骼肌在機體運動過程中有著很重要的作用，衡量骨骼肌組織學特性主要有2個重要指標：肌纖維直徑和肌纖維表面積密度。有研究顯示，在低氧環(huán)境下，牦牛的肌纖維直徑較棗北黃牛細[9]。這與本試驗中喜馬拉雅旱獺肌纖維直徑比SD大鼠細一致。肌纖維表面積密度是根據(jù)肌纖維數(shù)得到的，每個肌纖維就是1個肌細胞。低氧會導致動物骨骼肌受損，因此骨骼肌細胞通過不斷增生和促進骨骼肌肌纖維生成來達到適應低氧的目的。有研究表明，在單純?nèi)毖鯐r，骨骼肌細胞會發(fā)生增殖并在第21天達到最高峰，持續(xù)低氧28 d骨骼肌細胞增殖情況逐漸下降，這可能是骨骼肌開始適應低氧環(huán)境的表現(xiàn)[16]。在本試驗中，喜馬拉雅旱獺骨骼肌肌纖維表面積密度比SD大鼠大，這可能是因為喜馬拉雅旱獺長期生活在高原低氧環(huán)境中，其骨骼肌肌纖維受到環(huán)境影響逐漸變細，從而使肌纖維表面積密度增大，以達到適應高原環(huán)境的目的。

在低氧條件下，骨骼肌毛細血管的增生可以縮短氧從毛細血管向組織彌散的距離，進一步提高了組織供氧量，是組織與細胞對低氧環(huán)境的適應性反應，引起血管增生的主要原因是VEGF的高表達，而血管增生會導致MVD發(fā)生變化[17]。VEGF的高表達與機體在缺氧時產(chǎn)生低氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)密切相關，其包括HIF-1α和HIF-1β，HIF-1α參與組織細胞缺氧的反應。在缺氧時大量的HIF-1α表達可導致VEGF反轉(zhuǎn)錄水平上升而大量表達[18]。朱世海等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高原鼢鼠的MVD和VEGF顯著高于SD大鼠，高原鼢鼠通過MVD和VEGF的高表達特征來適應高二氧化碳的洞道生活。本試驗中喜馬拉雅旱獺骨骼肌中VEGF陽性表達率和MVD比SD大鼠高，說明喜馬拉雅旱獺對低氧環(huán)境已經(jīng)具有良好的適應性。

線粒體是細胞生命活動的場所，也是細胞內(nèi)氧化磷酸化和ATP形成的重要場所。細胞氧化磷酸化和ATP形成重要部位是線粒體的內(nèi)膜與嵴。有研究表明，低氧時線粒體會發(fā)生變形腫脹，嵴出現(xiàn)不同程度的斷裂損傷，從而減少氧化磷酸化和ATP形成[20]。線粒體形態(tài)的完整才能保證其正常功能，缺氧時機體通過增加線粒體的數(shù)目和面積從而加強對氧的利用。齊新章[21]研究表明，高原鼢鼠與高原鼠兔心肌組織對氧的攝取和利用能力較強，這與其心肌中線粒體面密度、面數(shù)密度大有關，心肌中線粒體通過增加線粒體數(shù)目和面數(shù)密度來提高機體對氧的攝取與利用。本試驗中喜馬拉雅旱獺骨骼肌線粒體的平均截面積和平均體積均小于SD大鼠；旱獺骨骼肌線粒體的體積密度和面數(shù)密度均大于SD大鼠。所以線粒體結(jié)構的特殊性可以使喜馬拉雅旱獺更好地適應低氧環(huán)境。

綜上所述，喜馬拉雅旱獺骨骼肌顯微結(jié)構的特殊性，是其適應高原低壓低氧環(huán)境的組織學基礎，喜馬拉雅旱獺骨骼肌結(jié)構特點說明其對高原環(huán)境存在良好的適應性，主要表現(xiàn)為骨骼肌的肌纖維直徑細，肌纖維表面積密度大，VEGF大量表達，MVD大，線粒體體積密度和面數(shù)密度高。