3株牛支原體對(duì)牛體的試驗(yàn)感染研究

駱 璐，陳忠瓊，謝建華，蔣佳利，凌洪權(quán)，歐陽吳莉，曾 政

(重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 渝北 401120)

牛支原體(Mycoplasmabovis，M.bovis)是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一種重要傳染性病原體，其能夠引起肉牛和奶牛支氣管炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎和乳腺炎[1]。1961年，美國最早報(bào)道了一起由牛支原體感染引起的牛乳腺炎[2]，而后，隨著牛及牛產(chǎn)品(牛乳、牛精液等)的國際貿(mào)易增加，該病原在世界范圍內(nèi)開始蔓延。2008年6月，我國湖北、重慶、甘肅、貴州、山東等地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)了以肺肉變及壞死為主要特征的牛呼吸道傳染病[3]，同年9月，辛九慶等首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，標(biāo)志著牛支原體在我國的定植[4]。

傳染性牛支原體肺炎是由牛支原體引起的，以壞死性肺炎為主要特征的牛細(xì)菌性呼吸系統(tǒng)疾病，患病率達(dá)50%～100%，平均病死率為10%，高者可達(dá)40%，這給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。研究顯示，該病原主要侵害3～12月齡的犢牛，牛一旦感染，可持續(xù)帶菌并排菌。在生產(chǎn)實(shí)際中，大量使用抗菌藥導(dǎo)致牛支原體的耐藥性逐漸升高[6-7]。為有效防控該病并防止超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)，已有大量研究報(bào)道了有關(guān)牛支原體滅活疫苗、亞單位疫苗等的研制，但國內(nèi)外仍無商業(yè)化的有效疫苗可用于預(yù)防牛支原體感染[8]。

本試驗(yàn)采用臨床分離到的3株牛支原體分離株感染犢牛，觀察并記錄感染犢牛的臨床癥狀和體征，剖檢觀察肺部病變情況，采用實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)牛支原體感染情況進(jìn)行分析，從而得出3株牛支原體分離株的特征，為疫苗株的篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒，購自北京寶威特生物技術(shù)有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自天根生化科技(北京)有限公司；PPLO Broth、PPLO Agar，均購自Becton Dickinson and Company；Yeast Extract、馬血清，均購自賽默飛世爾科技公司；青霉素鈉，購自成都科龍化工試劑廠；2×Taq酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA/RNA抽提試劑盒，購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠粉，購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；菌株保守序列擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菌株 采用本實(shí)驗(yàn)室前期從患有嚴(yán)重呼吸道癥狀的病/死牛肺部分離到的3株牛支原體分離株，分別為W70株、Q3株和JX02株，由本實(shí)驗(yàn)室暫存。牛支原體的復(fù)蘇培養(yǎng)和鑒定具體方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的文章[9]。復(fù)蘇后的菌種用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。引物序列：上游引物Mbl：5′-TTTAGCTCTCATTAGAACAAAT-3′；下游引物Mb2：5′-GCCTCTCTTTAAGAATGTC-3′。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇當(dāng)?shù)攸S牛與西門塔爾牛冷凍精液人工配種得到的4～7月齡子代犢牛12頭，經(jīng)檢測均為牛支原體陰性。所有受試犢牛雇傭?qū)Ｈ素?fù)責(zé)看護(hù)、飼喂、清掃和日常管理。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將12頭準(zhǔn)備進(jìn)行人工感染的犢牛隨機(jī)分為4個(gè)組，每組3頭，分別是感染組(W70組、Q3組和JX02組)和陰性對(duì)照組。同組犢?；烊猴曫B(yǎng)，不同組犢牛飼養(yǎng)圈舍相距10 m以上。感染組采用氣管環(huán)注射法進(jìn)行感染，用30 mL注射器吸取20 mL濃度為1×109CCU/mL的病原菌液體培養(yǎng)物，在咽部下方、靠近氣管上部，將注射器針頭穿透頸部皮膚和肌肉層后，從兩氣管環(huán)狀軟骨中間連接處進(jìn)針穿透氣管，緩慢推注菌液至氣管中。共人工感染2次，間隔時(shí)間7 d。陰性對(duì)照組采用相同方法、次數(shù)、劑量注射培養(yǎng)用的肉湯培養(yǎng)基。

1.5 犢牛人工感染牛支原體模型的建立 感染后30 d無菌剪取肺部病變組織，勻漿后涂布于固體培養(yǎng)基，挑取單菌落，采用煮沸法提取菌落DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳，如感染組出現(xiàn)陽性條帶，并結(jié)合觀察到的臨床癥狀，可判斷氣管環(huán)注射法使牛支原體在肺臟成功定植，犢牛人工感染牛支原體模型建立成功。

1.6 臨床觀察 感染后30 d內(nèi)，每天觀察犢牛的精神狀態(tài)、食欲狀況、反芻狀態(tài)、被毛情況、眼鼻分泌物情況、臨床三大體征(呼吸、脈搏、體溫)等。

1.7 剖檢觀察和組織病理學(xué)檢查 感染后30 d，剖檢所有犢牛，觀察肺部有無壞死灶、肺臟顏色變化情況、肺組織和胸腔粘連情況、胸腔積液情況、肺萎縮情況、肺部肉樣變情況等。記錄臟器病理變化情況并按照病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[10]，并結(jié)合實(shí)際略作改動(dòng)。剖檢觀察后，分別取陰性對(duì)照組正常肺部組織及感染組病變肺部組織，制成石蠟切片，在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

表1 病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]

1.8 血清抗體ELISA檢測 從感染開始第1天起，連續(xù)每天對(duì)所有犢牛進(jìn)行頸靜脈采血，4 ℃靜置過夜，分離血清，存放于-20 ℃，待30 d觀察期結(jié)束后統(tǒng)一用ELISA法進(jìn)行牛支原體血清抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 犢牛人工感染牛支原體模型的建立 3株牛支原體人工感染后，感染組犢牛均在2～7 d后開始出現(xiàn)不同程度呼吸道癥狀。鼻孔開始大量分泌黏液，并伴有少量膿性分泌物，眼角有淡黃色膿性分泌物。偶見咳嗽、噴嚏，聽診有啰音，其中以W70組最為明顯。陰性對(duì)照組未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。剖檢犢牛時(shí)無菌剪取肺部病變組織，勻漿后涂布于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)的菌落用PCR法進(jìn)行檢測，感染組出現(xiàn)陽性條帶，確定為牛支原體。上述臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果均證明本試驗(yàn)的動(dòng)物模型建立成功。

2.2 臨床三大體征監(jiān)測 比較各組試驗(yàn)犢牛的脈搏、體溫和呼吸頻率的平均水平，結(jié)果如圖1所示，陰性對(duì)照組和感染組的脈搏頻率均在正常值范圍內(nèi)(72～100 次/min)[11]；W70組的體溫和呼吸頻率均在人工感染后的第2天逐漸升高，到第2次人工感染(第7天)后出現(xiàn)大幅上升，到第9天體溫達(dá)到最高峰40.1 ℃，呼吸頻率達(dá)到最高頻次44 次/min；JX02組和Q3組也存在同樣的趨勢，但相對(duì)W70組幅度較小。

圖1 臨床三大體征變化

2.3 剖檢觀察 試驗(yàn)觀察期結(jié)束后剖檢試驗(yàn)犢牛結(jié)果顯示，感染組犢牛的肺部均存在不同程度的病變，包括肺臟出血、萎縮，表面圓形暗紅色壞死灶(圖2A)，局部出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)，肺部實(shí)變(圖2B)，氣管內(nèi)有大量黏性分泌物等；陰性對(duì)照組犢牛肺部質(zhì)地柔軟，顏色呈粉紅色，無病變(圖2C)。根據(jù)病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各感染組犢牛進(jìn)行分值累加并求平均數(shù)，結(jié)果W70組平均12.0分，JX02組平均7.3分，Q3組平均5.6分，陰性對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)病理變化，記為0分，評(píng)分結(jié)果見表2。

表2 病變情況評(píng)分

圖2 肺部剖檢觀察

2.4 組織病理學(xué)檢查 通過光學(xué)顯微鏡觀察肺部病理組織切片發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組肺小葉無肉眼可見病理變化(圖3A)；W70組表現(xiàn)為肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)充滿均質(zhì)漿液，肺泡擴(kuò)大，肺泡腔內(nèi)充滿大量的中性粒細(xì)胞，肺泡內(nèi)纖維素性滲出物，紅細(xì)胞大量溶血，中型粒細(xì)胞壞死、纖維素溶解，細(xì)支氣管周邊炎性浸潤，大量中性粒細(xì)胞聚集，血管周邊大量淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜(固有層)大量淋巴細(xì)胞浸潤，肺萎陷等(圖3B)；JX02組出現(xiàn)肺泡壁毛細(xì)血管紅細(xì)胞溶血，肺泡萎陷，細(xì)支氣管(終末)周邊肺泡壁增厚，局部淤血(圖3C)；Q3組出現(xiàn)細(xì)支氣管黏膜下淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚，周邊肺泡壁部分塌陷，周邊結(jié)締組織增生，細(xì)支氣管內(nèi)有散落的纖維素和中性粒細(xì)胞(圖3D)。

圖3 肺部組織病理切片(H.E.染色，400×)

2.5 血清抗體ELISA檢測 血清抗體檢測發(fā)現(xiàn)，各感染組的抗體水平變化趨勢相同。各感染組首次感染后血清抗體水平均有所升高，第2次感染后抗體水平均出現(xiàn)明顯增長趨勢，且均在感染后15 d時(shí)出現(xiàn)高峰，而后開始消減。其中W70組的抗體最高OD值可達(dá)1.24，直到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)抗體OD值仍維持在0.74；JX02組的抗體OD值峰值為1.15，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)消減至0.5，并有持續(xù)下降的趨勢；Q3組在首次感染后抗體水平較另外2個(gè)感染組高，達(dá)到峰值(1.01)的時(shí)間更早，但其峰值較低，且最終維持的抗體水平也最低(0.44)，見圖4。

圖4 血清抗體水平

3 討論

支原體在動(dòng)植物以及人體中廣泛存在，種類繁多，其中牛源支原體就有20多種[10]。為探究牛支原體的致病特性，本課題組前期通過牛支原體分離株感染健康雞胚和BALB/c小鼠成功復(fù)制了牛支原體感染的病理模型，在小鼠感染模型中，通過致死率對(duì)牛支原體的毒力進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)W70株對(duì)小鼠的毒力最強(qiáng)，其次是Q3株，最后是JX02株[12]。而本次犢牛的感染模型中，毒力強(qiáng)弱順序依次為W70株>JX02株>Q3株，說明相同的菌株會(huì)因不同環(huán)境、不同接種方式、不同宿主等表現(xiàn)出不同的侵襲力。因此，在進(jìn)行疫苗候選株篩選時(shí)，回歸本體動(dòng)物的攻毒試驗(yàn)是必不可少的環(huán)節(jié)。

通過對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的臨床癥狀觀察表明，本試驗(yàn)采用的氣管環(huán)注射法能夠成功還原牛支原體肺炎感染模型，感染組犢牛均表現(xiàn)出體溫升高、呼吸頻率加快等癥狀，而W70組在感染約10 d時(shí)，體溫和呼吸頻率均超過了正常范圍。此外，感染組犢牛還表現(xiàn)出咳嗽、流黏液性鼻液、眼部分泌物增多、腹式呼吸等臨床癥狀，這與自然感染所報(bào)道的臨床癥狀相似[13]。本試驗(yàn)感染組犢牛脈搏頻率均在正常值范圍內(nèi)，表明脈搏頻率受牛支原體感染的影響較弱。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，感染組犢牛的肺部組織均存在不同程度的病變，主要以間質(zhì)性肺炎和纖維素性滲出性肺炎為主，其中W70組的肺部組織損傷最為嚴(yán)重，該結(jié)果也證明了W70株對(duì)牛的肺部有較高的致病性。

本試驗(yàn)血清抗體檢測結(jié)果顯示，無論是毒力較強(qiáng)的W70株還是其他2個(gè)毒力較弱的JX02株和Q3株，均在首次感染后約15 d時(shí)達(dá)到最高抗體水平，但高濃度的抗體水平持續(xù)時(shí)間較短，這也是支原體在牛群中難以消除、易反復(fù)感染的原因之一。提示在今后牛支原體疫苗的實(shí)際應(yīng)用中，若要維持較高的抗體水平，還需更進(jìn)一步制定合理的免疫程序和確定合適的免疫劑量。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛支原體W70株、JX02株和Q3株對(duì)犢牛均有致病性，但W70株的毒力最強(qiáng)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果[14]，這可能與W70株的全菌蛋白條帶數(shù)量較多有關(guān)，牛支原體侵襲力與蛋白質(zhì)表達(dá)量和功能的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究?？傊?，本試驗(yàn)成功篩選出W70株作為牛支原體疫苗候選株，同時(shí)也為后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究和牛支原體細(xì)胞感染模型的建立提供了思路。