穩(wěn)定表達Cas9蛋白的BHK-21單克隆細胞系的建立與鑒定

葛麗娟，權(quán) 冉，陳俊貞，袁圓圓，付 強，李澤宇，史慧君

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最早由Ishino等于1987年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[1]。CRISPR是存在于細菌和古細菌細胞中抵御外源DNA侵入的適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)[2]。這些生物基因組中的CRISPR位點可以表達與入侵病毒的基因組序列匹配的小分子RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種時，CRISPR RNA能夠通過互補序列與病毒基因組結(jié)合并表達CRISPR相關(guān)酶(Cas酶)[3]。這類核酸酶切割病毒DNA以防止其功能完成，而由CRISPR序列組成的CRISPR/CAS系統(tǒng)是細菌中重要的獲得性免疫系統(tǒng)[4]。

目前，在自然界中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/CAS系統(tǒng)分為三類：Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類[5-6]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于II類，其利用與靶序列互補的向?qū)NA來引導Cas9酶用于DNA的定點切割，能夠?qū)Σ溉閯游锛毎蚪M進行精準修飾，被廣泛用于功能基因的篩選[7]。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，在藥物研發(fā)、基因功能、基因治療以及病毒宿主相互作用的關(guān)鍵分子篩選等方面取得了重大進展[8-12]，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到動物領(lǐng)域。多個研究團隊通過CRISPR/Cas9敲除文庫(Genome CRISPR knockout libraries，GeCKO)進行大規(guī)模的遺傳篩選，如參與人類免疫缺陷病毒復制階段的宿主蛋白[13]，利用功能性缺失型策略篩選獲得影響豬乙型腦炎病毒感染的功能基因[14]。篩選研究的第1步是構(gòu)建慢病毒載體，用慢病毒包裝sgRNA文庫，并以較低的病毒感染復數(shù)轉(zhuǎn)導至表達Cas9的細胞系，從而構(gòu)建全基因組敲除細胞文庫[15]。因此，構(gòu)建穩(wěn)定表達Cas9的細胞系是建立基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因敲除細胞文庫必不可少的。本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達Cas9蛋白的BHK-21-Cas9單克隆細胞系，可用于轉(zhuǎn)導CRISPR/Cas9敲除文庫，建立基因敲除細胞文庫，為篩選影響病毒感染和復制的功能基因提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細胞 pSPAX2(12260)、pMD2.G(12259)、pLenti-GFP(17448)、lentiCas9-Blast(52962)和lentiGuide-Puro(52963)質(zhì)粒，均購自北京中原有限公司。人胚腎細胞(HEK-293T)和乳倉鼠腎細胞(BHK-21)，均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長培養(yǎng)基為高糖DMEM添加10%胎牛血清。

1.2 試劑和儀器 聚凝胺(Polybrene，TR-1003)，購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)(49553-93-7)，購自美國Polysciences公司；PBS(10010023)和0.25% Trypsin-EDTA(25200056)，均購自美國英杰生命技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒(P0010S)、Western及IP細胞裂解液(P0013)和BeyoECL Moon化學發(fā)光試劑盒(P0018FS)，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BsmB I-v2(#E1602)，購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；Blasticidin-S(B139600)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高糖DMEM(06-1055-57-1)和胎牛血清(04-001-1)，均購自以色列Biological Industries(BioInd)公司；Stbl3感受態(tài)細胞，購自福因德科技(武漢)有限公司；重組Anti-CRISPR-Cas9抗體(ab189380)，購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)抗體和GAPDH Antibody 10494-1-AP抗體，均購自艾克索生物科技股份有限公司。低溫高速離心機、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、移液器，均購自德國艾本德股份公司；倒置熒光顯微鏡(Nikon TE2000U)，購自尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計，購自賽默飛世爾科技公司；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備公司。

1.3 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 慢病毒的制備 取對數(shù)生長期的HEK-293T細胞接種于直徑為100 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度達到80%～90%時，將質(zhì)粒lentiCas9-Blast以及對照質(zhì)粒pLenti-GFP分別與輔助質(zhì)粒pSPAX2、pMD2.G按質(zhì)量2∶2∶1的比例共轉(zhuǎn)染至HEK-293T中，加入質(zhì)?？傎|(zhì)量5倍的PEI(濃度為1 mg/mL)促進轉(zhuǎn)染，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后更換為含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，獲得表達Cas9蛋白的慢病毒(試驗組)以及表達GFP綠色熒光蛋白的慢病毒(對照組)，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用對照組pLenti-GFP在顯微鏡下觀察的綠色熒光表達情況，估算試驗組慢病毒的包裝效率。

1.3.2 慢病毒感染及陽性細胞初篩 取對數(shù)生長期的BHK-21細胞接種于直徑為60 mm培養(yǎng)皿，按照慢病毒原液∶完全培養(yǎng)基=1∶1的比例懸浮感染細胞，加入終濃度為8 μg/mL的聚凝胺溶液，輕輕混勻。培養(yǎng)24 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用25 μg/mL的Blasticidin S進行藥物壓力篩選，連續(xù)篩選數(shù)天后待野生型BHK-21細胞全部死亡時，將試驗組細胞培養(yǎng)液更換為加入了低濃度抗生素(初始濃度的1/3)的含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞不再死亡且生長狀態(tài)良好。

1.3.3 有限稀釋法培養(yǎng)單克隆細胞 將長滿單層的細胞消化成單個懸浮狀態(tài)后，使用血細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度為8～10個/mL，接種于96孔板，每孔加100 μL含15% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，接種時不斷吹打混勻細胞懸液，避免細胞沉淀而造成接種不勻。待細胞貼壁，觀察并標記單細胞孔。待單細胞孔中形成細胞集落，消化為單個懸浮細胞后轉(zhuǎn)移至48孔板中擴大培養(yǎng)。

1.3.4 細胞系的Western blot鑒定 穩(wěn)定表達Cas9蛋白的多克隆細胞系和單克隆細胞系通過Western blot方法檢測Cas9蛋白的表達進行鑒定。將細胞培養(yǎng)基盡量吸棄干凈，用預冷的PBS清洗2遍，棄去PBS后用含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液裂解細胞，冰上裂解后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，提取上清總蛋白；根據(jù)BCA法測定總蛋白濃度，取50 μg總蛋白加入蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴100 ℃ 5 min使蛋白變性；經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別以Anti-CRISPR-Cas9抗體(1∶2 000稀釋)和GAPDH Antibody 10494-1-AP抗體(1∶5 000稀釋)為一抗，4 ℃搖床孵育過夜；TBST清洗后使用HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)抗體(1∶5 000稀釋)為二抗室溫孵育1 h；TBST清洗后用ECL全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測目的蛋白的表達。

1.4 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9核酸酶功能鑒定

1.4.1 gRNA的設(shè)計與合成 根據(jù)緊密連接蛋白(Occludin，OCLN)的基因序列，利用在線向?qū)NA(Short guide RNA，sgRNA)設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計針對OCLN基因的sgRNA：上游5′-CACCGAGGATCCGAATCACTCCCGG-3′，下游5′-AAACCCGGGAGTGATTCGGATCCTC-3′。將合成好的gRNA經(jīng)過磷酸化、退火后形成雙鏈DNA。

1.4.2 載體構(gòu)建 將lentiGuide-Puro空質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶BsmB I酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物。通過T4連接酶將退火磷酸化后的gRNA產(chǎn)物與酶切回收產(chǎn)物連接，4 ℃過夜后得到連接產(chǎn)物。通過熱擊法將連接產(chǎn)物加入Stbl3感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化，將加入連接產(chǎn)物的感受態(tài)細胞均勻混入不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖菌1 h后，1 000 r/min離心2 min，棄上清，保留100 μL培養(yǎng)基，輕柔混勻后涂布于含氨芐青霉素抗性的平板中篩選。16 h后挑取單克隆至含氨芐青霉素抗性的200 μL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖菌1.5 h后，進行PCR鑒定，鑒定正確的菌種搖菌16 h后，取700 μL用于進一步測序鑒定，其余菌液提取質(zhì)粒后凍存。

1.4.3 重組慢病毒的包裝 利用PEI轉(zhuǎn)染試劑將重組慢病毒質(zhì)粒lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA 與輔助質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染至HEK-293T中，操作方法同1.3.1，將收集的慢病毒原液懸浮感染部分穩(wěn)定表達Cas9的BHK-21單克隆細胞，操作方法同1.3.2。感染48 h后，使用Puromycin(終濃度為4 μg/mL)進行抗性篩選3 d。

1.4.4 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9核酸酶功能鑒定 抗性篩選后繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度達到90%后，取部分細胞提取蛋白，使用Western blot檢測OCLN蛋白敲除情況，以未感染lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA慢病毒為對照，操作方法同1.3.4。OCLN蛋白表達量越低，表明Cas9活性越好。

2 結(jié)果

2.1 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 構(gòu)建BHK-21-Cas9多克隆細胞系 質(zhì)粒lentiCas9-Blast以及對照質(zhì)粒pLenti-GFP分別與輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞48 h后，對照質(zhì)粒pLenti-GFP細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖1A～1C)。慢病毒感染BHK-21細胞48 h后，對照質(zhì)粒pLenti-GFP細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖1D～1F)。通過pLenti-GFP慢病毒作為熒光陽性對照，熒光細胞密度達90%以上，表明慢病毒感染性較好。

圖1 pLenti-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞及感染BHK-21細胞

2.1.2 細胞系的Western blot鑒定 經(jīng)Western blot鑒定Cas9蛋白表達，陽性細胞傳至5代后，再次鑒定Cas9蛋白的表達。結(jié)果顯示，BHK-21-Cas9細胞系在184 kDa出現(xiàn)目的條帶，表明Cas9蛋白在BHK-21細胞中穩(wěn)定表達(圖2)。將上述陽性細胞經(jīng)有限稀釋的方法得到18株狀態(tài)良好的單克隆細胞系(編號1～18)和野生型BHK-21細胞，進行3次Western blot重復鑒定，使用Image J軟件進行條帶灰度值分析，結(jié)果顯示，17株單克隆細胞表達Cas9蛋白，其中編號1、2、15、16、18五株細胞系Cas9的表達量高(圖3、圖4)。

圖2 BHK-21-Cas9陽性細胞的Western blot鑒定

圖3 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Western blot鑒定

圖4 Western blot條帶灰度分析

2.2 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9核酸酶功能鑒定

2.2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將引物連接至用BsmB I酶切后的lentiGuide-Puro空質(zhì)粒載體，使用Snapgene構(gòu)建的圖譜見圖5。

圖5 LentiGuide-Puro-OCLN圖譜

2.2.2 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9核酸酶功能鑒定 選取了4株2.1.2中鑒定的Cas9表達量較高的BHK-21單克隆細胞系進行Cas9核酸酶編輯功能鑒定，進行3次重復試驗，結(jié)果顯示，編號15和16兩株BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9編輯效果較好(圖6)。

圖6 BHK-21-Cas9單克隆細胞系的Cas9核酸酶功能鑒定

3 討論

如何防治病毒感染和傳播是近些年來一直被關(guān)注的熱點問題。病毒以單鏈或雙鏈螺旋形式，以RNA或DNA的形式攜帶其遺傳信息。病毒作為一種嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物，依靠宿主細胞代謝系統(tǒng)完成其生命周期[16]。為了成功傳播，病毒必須借助宿主細胞中特定的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，病毒復制和傳播的核心是病毒—宿主蛋白相互作用的形成[17]。大量研究證實，可以通過改變與病毒存活密切相關(guān)的宿主蛋白的表達水平，進而來實現(xiàn)調(diào)節(jié)病毒復制的目的[18]。因此，尋找與病毒復制相關(guān)的功能基因并揭示其作用機制將有助于闡明病毒的感染機制。

近年來，開發(fā)了幾種新的基因組編輯技術(shù)。其中，鋅指核酸酶(Zincfinger nucleases,ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9 RNA引導的核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)是使用最為廣泛的。每種技術(shù)都使用限制性內(nèi)切酶在同源結(jié)合蛋白或RNA的指導下在靶點引入DNA雙鏈斷裂。ZFNs和TALENs需要對每個新靶位點使用大DNA片段(500～1 500 bp)重新編碼蛋白質(zhì)，而CRISPR/Cas9可以通過改變20 bp原型間隔區(qū)輕松適應(yīng)任何基因組序列RNA，可以通過將該核苷酸序列亞克隆到gRNA質(zhì)粒骨架中來完成，Cas9蛋白成分保持不變。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9的易用性是一個顯著優(yōu)勢，尤其是在生成大量載體以靶向眾多位點[19]甚至全基因組文庫[20-22]。CRISPR/Cas9的另一個潛在優(yōu)勢是多路復用的能力，即并行使用多個gRNA來同時靶向同一細胞中的多個位點[23]，這使得一次突變多個基因或在基因組區(qū)域中設(shè)計精確缺失變得簡單。

LentiCRISPRv2/lentiGuide-Puro是用于CRISPR/Cas9基因編輯的第3代慢病毒載體[24]。LentiCRISPRv2包含2個重要的元件：hspCas9和嵌合的前導RNA，LentiCRISPRv2是一種用于傳遞CRISPR成分的單一病毒載體。lentiGuide-Puro只有sgRNA，沒有Cas9元件，必須與lentiCas9-Blast結(jié)合使用。lentiCRISPRv2從第1代lentiCRISPRv1升級而來，其產(chǎn)毒效率(病毒滴度)約是第1代的10倍。lentilGuide-Puro的產(chǎn)毒效率則更高，大約是lentiCRISPRv2的10倍，但用lentilGuide-Puro轉(zhuǎn)染的細胞系需要預先整合Cas蛋白。為了得到更高的效率，本研究選擇了lentiGuide-Puro作為傳遞載體。

CRISPR/Cas9在向?qū)NA的引導下利用Cas9蛋白對某個特定的基因位點進行切割，出現(xiàn)DNA的雙鏈的切口[25]。這個切口促使細胞產(chǎn)生自我修復，主要有2種形式：非同源性末端接合和同源重組，通過這2種形式可以實現(xiàn)內(nèi)源基因的定向敲除或靶向插入外源基因[26]。當細菌中有同源臂時，可以實現(xiàn)高效的同源重組。這種機制也為本研究提供了使用同源重組檢測體內(nèi)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的思路。在檢測Cas9核酸酶編輯功能時，根據(jù)緊密連接蛋白OCLN基因序列，設(shè)計針對OCLN基因的sgRNA，構(gòu)建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重組質(zhì)粒，將lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重組載體通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染BHK-21-Cas9單克隆細胞系，陽性篩選后，以未感染lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA慢病毒為對照，OCLN蛋白表達量越低，表明Cas9編輯效果越好。

本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達Cas9蛋白的BHK-21-Cas9單克隆細胞系，可以用于CRISPR/Cas9敲除文庫的轉(zhuǎn)導，建立基因敲除細胞文庫，為篩選影響病毒感染和復制的功能基因提供了科學依據(jù)。