非小細(xì)胞肺癌組織中細(xì)胞遷移誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶1的表達(dá)及臨床意義

宋志雨，李陶威，張耀勇

漯河市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 漯河 462000

肺癌在中國(guó)惡性腫瘤死亡原因中居首位，其發(fā)病率及病死率均高于其他惡性腫瘤[1]。目前肺癌的病理機(jī)制還未研究透徹。報(bào)道指出，肺癌的形成與細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵基因突變有關(guān)，與癌基因異常活躍和抑癌基因活性降低或不表達(dá)有關(guān)[2]。根據(jù)腫瘤的病理表現(xiàn)及異質(zhì)性可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。在該分類中，NSCLC占比更高。近年來(lái)，NSCLC的治療效果顯著提高，但與醫(yī)師治療期望仍有較大差距。分析原因發(fā)現(xiàn)，首先早期診斷證據(jù)缺乏NSCLC的特異性DNA片段，若知曉分子標(biāo)記的特點(diǎn)，就可提高早期診斷率，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間；其次放化療對(duì)無(wú)法手術(shù)的晚期NSCLC患者效果不理想，近些年來(lái)針對(duì)特定基因突變的靶向治療為腫瘤治療指出了新的方向。但目前僅有少數(shù)專門(mén)針對(duì)這些突變的靶向藥，受益患者不多；最后制訂不恰當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄒ鄷?huì)影響患者的生活質(zhì)量和健康情況。研究指出，根據(jù)與化療相關(guān)的基因突變制訂治療方法是可行的[3-4]。然而基于現(xiàn)有的基因突變，還存在檢測(cè)誤差大等問(wèn)題。1994年，有學(xué)者將互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)一列入HUGE蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中編碼這些蛋白質(zhì)的基因統(tǒng)一被稱為KIAA基因，并在其后面給予4個(gè)數(shù)字加以區(qū)分。細(xì)胞遷移誘導(dǎo)透明質(zhì)酸酶1（cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP，也稱 KIAA1199）最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)耳中高表達(dá)，近年來(lái)的研究表明，KIAA1199與NSCLC的發(fā)展密切相關(guān)，探討KIAA1199在NSCLC患者中的表達(dá)有助于準(zhǔn)確尋找特異性DNA片段，對(duì)評(píng)估患者病情和預(yù)后、提高治療效果具有重要意義。本研究探討NSCLC組織中KIAA1199的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年8月至2017年8月漯河市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診為NSCLC；②入院前未接受過(guò)放化療、靶向治療或手術(shù)治療；③術(shù)前檢查排除其他腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②除肺臟外其他臟器衰竭；③轉(zhuǎn)移性肺癌；④具有家族遺傳病史。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入124例患者，其中男 67例，女 57例；平均（58.31±5.28）歲。收集NSCLC組織124例和癌旁組織（距離病灶2 cm以上）124例，標(biāo)本均由手術(shù)取材獲得。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)KIAA1199表達(dá)情況

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NSCLC組織和癌旁組織中KIAA1199的表達(dá)情況，具體步驟如下：①烤片。檢查電烤箱是否完好，預(yù)定溫度為60℃，預(yù)熱完成后烘烤30 min，切片數(shù)量少、形狀小則需適當(dāng)縮減時(shí)間。②脫蠟、水化。將烘烤后的切片置于二甲苯溶液中，浸泡5 min后取出，靜置5 min脫蠟。然后置于100%、95%、75%的乙醇溶液中，分別浸泡5 min，完成水化。水化后將切片用流動(dòng)水沖洗，將乙醇洗去，但注意不能用力沖洗。③高壓抗原修復(fù)。將500 g檸檬酸鈉溶解于2 L蒸餾水中，溶解充分后置于高壓蒸汽鍋，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽鍋出汽后等待2 min，然后關(guān)閉電源，待切片自然冷卻后取出。分兩次浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫組化筆在組織旁畫(huà)圈，為預(yù)加試劑固定于切片做準(zhǔn)備。然后滴加3%過(guò)氧化氫，靜置10 min，再用PBS溶液清洗3次，甩干。⑤一抗孵育。1∶100稀釋一抗，于4℃冰箱中過(guò)夜。⑥二抗孵育。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。滴加二抗，室溫下靜置30 min，PBS浸泡3次，每次3 min。⑦二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色?，F(xiàn)用現(xiàn)配DAB試劑并滴加，等待1 min后用PBS清洗3次。⑧蘇木素染色，染色30 s后用自來(lái)水沖洗1～2次，甩干。⑨脫水、封片。將切片依次置于75%、95%、100%的乙醇中，時(shí)間均為3 min，然后在組織中央滴一滴中性樹(shù)脂，進(jìn)行封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

KIAA1199主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)呈黃色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例﹤10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例10%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例51%～80%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞比例﹥80%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色計(jì)0分，為弱陽(yáng)性（+）；淡黃色計(jì)1分，為陽(yáng)性（++）；黃色計(jì)2分，為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，≥4分為高表達(dá)，﹤4分為低表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo)

比較NSCLC組織和癌旁組織中KIAA1199的表達(dá)情況，比較不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199的表達(dá)情況。所有患者均隨訪3年，比較KIAA1199高表達(dá)和低表達(dá)患者的3年總生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織和癌旁組織中KIAA1199表達(dá)情況的比較

NSCLC組織中KIAA1199高表達(dá)率為74.19%（92/124），明顯高于癌旁組織的35.48%（44/124），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.513，P=0.001）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199高表達(dá)率分別高于鱗狀細(xì)胞癌、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199表達(dá)情況的比較

2.3 生存情況的比較

KIAA1199高表達(dá)患者的3年總生存率為22.83%（21/92），明顯低于KIAA1199低表達(dá)患者的53.12%（17/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.932，P=0.003）。

3 討論

明確可以預(yù)測(cè)預(yù)后的分子標(biāo)志物對(duì)肺癌患者治療方案的制訂和生存期的延長(zhǎng)具有重要作用。影響肺癌預(yù)后的原因眾多，機(jī)制煩瑣。目前臨床中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可作為評(píng)估肺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)[5]。MMP9表達(dá)水平與肺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況相關(guān)。除MMP9外，在肺癌組織的腫瘤浸潤(rùn)環(huán)境中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MMP2等水解酶的活性較高，特別是外周血MMP9水平與肺癌的惡性程度有關(guān)，可為監(jiān)測(cè)晚期肺癌患者的病情提供依據(jù)[6]。有研究指出，微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)氧化酶 2（cyclooxgenase 2，COX2）、DNA修復(fù)基因等均與肺癌具有直接關(guān)系，但其判斷預(yù)后的效果不佳[7-8]。肺癌標(biāo)志物雖然很多，但目前為止還未發(fā)現(xiàn)診斷效能高的分子標(biāo)志物，盡快找出明確的生物標(biāo)志物對(duì)肺癌早期診斷及預(yù)后評(píng)估具有重要意義[9-10]。

KIAA1199基因最先在耳聾患者中發(fā)現(xiàn)，其在聽(tīng)力障礙者的耳蝸及內(nèi)耳中表達(dá)異?；钴S，與患者聽(tīng)力功能減退存在一定關(guān)聯(lián)，故稱為“耳聾基因”[11-12]。進(jìn)一步研究指出，結(jié)腸癌組織中KIAA1199表達(dá)上調(diào)，涉及WNT通路的多個(gè)基因激活，且KIAA1199水平越低，WNT通路對(duì)腫瘤發(fā)生的影響越小，越能夠抑制腫瘤進(jìn)一步發(fā)展[13-15]。除大腸癌外，肝癌、胰腺癌、胃癌細(xì)胞中KIAA1199也呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1199可與肺癌特異性結(jié)合多肽形成一種復(fù)合物，該復(fù)合物可提示早期肺癌的浸潤(rùn)深度[16-18]。

本研究探討了KIAA1199在NSCLC組織中的表達(dá)情況及臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中KIAA1199高表達(dá)率為74.19%，明顯高于癌旁組織的35.48%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。表明KIAA1199表達(dá)情況與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。

KIAA1199蛋白可提高細(xì)胞耗氧需求進(jìn)而造成缺氧，促使細(xì)胞遷移。同時(shí)KIAA1199可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)散，但其對(duì)肺癌的具體作用機(jī)制仍未研究清楚。研究表明，KIAA1199可干擾WNT通路的活性，通過(guò)自身作用改變下游靶分子的功能，提高NSCLC細(xì)胞的侵襲能力，加速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)正常細(xì)胞凋亡[19]。還有研究指出，在NSCLC中，miRNA-486-5p是改變KIAA1199活性的關(guān)鍵因子，其通過(guò)促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達(dá)使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常活躍，繼而激活下游信號(hào)通路，阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞再生長(zhǎng)[20]。以上研究結(jié)果說(shuō)明，KIAA1199在NSCLC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，腺癌、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者NSCLC組織中KIAA1199高表達(dá)率分別高于鱗狀細(xì)胞癌、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。說(shuō)明KIAA1199表達(dá)與NSCLC患者的病理類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)。KIAA1199高表達(dá)NSCLC患者的3年總生存率為22.83%，明顯低于KIAA1199低表達(dá)患者的53.12%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01），提示KIAA1199與NSCLC患者的預(yù)后有關(guān)。根據(jù)以上結(jié)果，下一步的研究可分析NSCLC治療效果與KIAA1199表達(dá)情況的關(guān)系，根據(jù)KIAA1199的表達(dá)情況制訂個(gè)性化治療方案，探究是否可以提高療效，改善生活質(zhì)量。而另一方面，KIAA1199低表達(dá)患者的病情相對(duì)較輕，能否減少化療療程，仍需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，KIAA1199在NSCLC組織中高表達(dá)，其與NSCLC患者的臨床特征及預(yù)后有關(guān)，可為預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。