樊 威 周狄文 王 均 賀 揚 卓 婷 楊 海 吳 俊 蘇 建*
(1四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,四川內(nèi)江 641000;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川成都 611130;3內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室,四川內(nèi)江 641000)
斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)又稱溝鯰、鉗魚,屬鯰形目鮰科,原產(chǎn)于北美洲,是一種生長性能優(yōu)、抗逆性強、肉質(zhì)上乘的大型淡水魚類。自1984年引進后在全國大面積養(yǎng)殖[1]。隨著集約化養(yǎng)殖的增加、種質(zhì)資源的退化以及抗生素的濫用,斑點叉尾鮰疾病的暴發(fā)呈逐年遞增趨勢。報道顯示,斑點叉尾鮰細菌性疾病危害最大,包括細菌性敗血癥、腸型敗血癥、柱形病、套腸癥等[2]。近幾年,斑點叉尾鮰套腸病在各地頻繁暴發(fā),往往發(fā)病突然、傳染迅速、死亡率居高不下,給斑點叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。以往報道顯示,斑點叉尾鮰套腸癥主要由嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌引起[3],后來有人發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬的細菌也能引起套腸癥[4-5]。
嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬弧菌科氣單胞菌屬,是典型的人-獸-魚共患病病原[6]。據(jù)目前的相關(guān)報道,各類淡水魚均可感染嗜水氣單胞菌,多數(shù)魚類感染嗜水氣單胞菌后均表現(xiàn)為典型的敗血癥,但情況略有不同。嗜水氣單胞菌可致異育銀鯽發(fā)生溶血性腹水病[7]、黃顙魚發(fā)生腹水病[8]以及草魚發(fā)生細菌性敗血癥[9]等。
2020年10月底,隨著氣溫突然回升,四川省樂山地區(qū)養(yǎng)殖斑點叉尾鮰出現(xiàn)爆發(fā)性死亡,主要表現(xiàn)為體表脫黏、體色變淡以及腸道套疊等癥狀,造成當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖斑點叉尾鮰大量死亡。為了弄清此次斑點叉尾鮰發(fā)病死亡原因,本研究采集癥狀明顯的患病斑點叉尾鮰進行了生物性病原檢測,并對分離細菌進行了藥物敏感試驗,以期為該細菌引起斑點叉尾鮰套腸癥的防控提供參考。
1.1.1 主要試驗對象。患病活體斑點叉尾鮰4尾(33±5 cm),由四川省樂山市井研縣某斑點叉尾鮰養(yǎng)殖場提供;20尾健康斑點叉尾鮰,由長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室提供。
1.1.2 試驗試劑。腦心浸液培養(yǎng)基(BHI),購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司;細菌生化微量鑒定管,購自杭州天和生物試劑有限公司;Master mix和細菌DNA提取試劑盒,購自天根生化科技有限公司;藥敏紙片,購自杭州微生物試劑有限公司;水質(zhì)快速分析試劑盒,購自湖南漁美康生物技術(shù)公司。
1.2.1 現(xiàn)場調(diào)查。通過現(xiàn)場調(diào)查的方式,詢問養(yǎng)殖戶近期斑點叉尾鮰死亡情況以及用藥情況,并且觀察、記錄水體顏色。使用賽氏透明度盤測定水體透明度并記錄。使用水質(zhì)快速分析試劑盒測定患病魚池塘中的氨氮、亞硝酸鹽、pH值以及溶解氧含量。
1.2.2 剖檢觀察。取患病斑點叉尾鮰,觀察其體表、頭部、鰓蓋、鰓絲、眼球、鰭條、肛門等部位有無明顯病變并記錄,解剖患病斑點叉尾鮰內(nèi)臟觀察并記錄。
1.2.3 寄生蟲檢測。取少量患病斑點叉尾鮰鰓絲、體表黏液以及腸道黏液壓片,置于顯微鏡下觀察并記錄是否有寄生蟲產(chǎn)生。
1.2.4 細菌的分離與純化。按無菌操作的方法,取病變明顯的斑點叉尾鮰肝臟、脾臟和腎臟,在無菌環(huán)境下接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基上,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后進行革蘭氏染色并觀察其純度,純度較大的部位劃線接種到一個新的BHI瓊脂培養(yǎng)基上進行擴配,得到純化的菌株后使用甘油保存。
1.2.5 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定與生化鑒定。將純化完的菌株接種于BHI培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)24 h,觀察其菌落形態(tài)大小。經(jīng)過革蘭氏染色后,置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征,并拍照或畫圖記錄。之后挑取單個菌落接種于微量生化管中,在28℃下培養(yǎng)24~48 h。
1.2.6 分子生物學(xué)鑒定。分別挑取分離得到的不同形態(tài)病原菌,接種于無菌BHI液體培養(yǎng)基,28℃過夜振蕩培養(yǎng)。取2 mL菌液,使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌DNA。采用細菌16S(16S rRNA)和gyrB基因通用引物(表1)進行PCR擴增,引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)在25 μL體系中進行:PCR Premix 12.5 μL,上游引物1.0 μL,下游引物 1.0 μL, 模板 DNA 2.0 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,循環(huán)擴增30次,最后72℃延伸10 min,于12℃結(jié)束反應(yīng)。預(yù)計擴增片段約1 500 bp和1 200 bp。以1%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物,將預(yù)期片段PCR送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。
表1 細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物
1.2.7 序列比對與構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將所測得的序列提交GenBank獲取相應(yīng)登錄號,并在NCBI網(wǎng)站中進行相似性搜索。選取相似性較高的典型序列與病原菌序列進行比對,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,確定菌株分類和進化地位。
1.2.8 致病菌株毒力測定。先將分離純化后的菌株接種于BHI平板上,于28℃培養(yǎng)24 h后,用0.85%無菌生理鹽水1 mL清洗菌苔備用,并用革蘭氏染色檢驗菌株純度。之后,按菌液0.4 mL和生理鹽水3.6 mL的比例,用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整細菌濃度。試驗組按照1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL 的濃度對斑點叉尾鮰腹鰭基部進行注射感染,每組注射5尾健康斑點叉尾鮰,注射劑量為0.2 mL/尾;對照組注射等量無菌生理鹽水。試驗時間為1周,在此期間不進食,用塑料箱暫養(yǎng)且水溫保持在(25±2)℃,連續(xù)增氧24 h,觀察斑點叉尾鮰的活動情況、發(fā)病癥狀和死亡情況,并對死亡斑點叉尾鮰進行細菌檢查。
1.2.9 藥敏試驗。無菌環(huán)境下采用紙片擴散法(K-B法)進行。取分離純化的細菌,用接種環(huán)挑取形態(tài)、大小一致的菌落在新平板上劃線;然后加入0.85%生理鹽水1 mL,使用無菌棉簽均勻涂布于接種的平板上。將21種含常用抗菌藥的紙片貼在平板上,28℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑的大小,判斷病原菌對藥物的敏感程度。
該池塘斑點叉尾鮰發(fā)病時間約為1個月,發(fā)病魚癥狀主要表現(xiàn)為行動遲緩,食欲減退,肛門紅腫,體表色淡、脫黏,部分魚體表有圓形褪色斑或口腔出血并有淡黃色污物附著,死亡量較大,嚴(yán)重時死亡量達到1 000~1 500 kg。
病魚體色變淡、黏液減少,腸道出現(xiàn)明顯套疊。解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)紅出血,脾腎腫大、出血,胃和腸道出血、發(fā)炎,部分腦內(nèi)充血、出血(圖1)。
鰓絲壓片結(jié)果表明,鰓絲壓片未觀察到寄生蟲。體表黏液壓片表明,體表黏液中未觀察到寄生蟲。
利用穿刺接種技術(shù)將病變明顯的肝臟、脾臟和腎臟劃線接種于BHI培養(yǎng)基,28℃恒溫培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)基上形成圓形、表面光滑的半透明乳白色針尖狀菌落,分別挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色,置于顯微鏡下觀察,確定分離細菌為革蘭氏陰性短桿菌(圖2)。
以分離菌株的DNA為模板,用細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物進行PCR擴增,經(jīng)電泳檢測和凝膠成像后,16S rRNA基因于1 500 bp左右得到其目的條帶,gyrB基因于1 300 bp左右得到其目的條帶(圖 3)。
將分離菌株的16S rRNA序列(LSCC20201)與gyrB序列(LSCC20202)于 GenBank中查找相關(guān)序列,在NCBI網(wǎng)站中進行Blast分析,選擇與該序列具有較高同源性的核酸序列。按照以上方法,在基因庫里下載嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和熒光假單胞菌共5類已公開的序列,與菌株序列在MEGA 6.0軟件中進行多次比對,最后采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,通過Bootstrap檢驗分析各分枝的置信度。在16S rRNA序列、gyrB序列上,分離菌株均聚在嗜水氣單胞菌的分支上。從生理生化試驗結(jié)果來看,菌株為嗜水氣單胞菌(圖4)。
將分離純化菌株培養(yǎng)后稀釋成 1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL的濃度對斑點叉尾鮰進行腹腔注射(0.2mL/尾),24 h后,斑點叉尾鮰開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為急性充血、出血,72h死亡率達高峰(表2),且部分出現(xiàn)套腸癥狀。對照組未出現(xiàn)死亡。
表2 人工感染試驗結(jié)果
為進一步判斷病原菌對藥物的敏感程度,選取21種常用抗生素,采用紙片法,分別對分離得到的菌株進行混合藥敏試驗(圖5)。該菌株對氧氟沙星和氟苯尼考敏感,對其他藥物低度敏感或不敏感,具體結(jié)果見表3。
表3 患病魚分離菌株的藥敏試驗結(jié)果
斑點叉尾鮰套腸癥又稱為斑點叉尾鮰腸套疊癥,1988年在美國就有斑點叉尾鮰類似腸斷裂的疾病報道,并且從病魚器官中分離到嗜水氣單胞菌、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnar)等多種細菌[10],但沒有證據(jù)將這些分離細菌與疾病之間的關(guān)系建立起來。汪開毓等[11]認為,嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是斑點叉尾鮰套腸癥的病原,但其致病性較嗜水氣單胞菌更高,患病斑點叉尾鮰更易出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象。之后,也有研究報道顯示,嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等細菌也能夠引起斑點叉尾鮰套腸癥[4]。研究發(fā)現(xiàn),套腸癥發(fā)生時間過長,易引起腸道缺血,降低消化能力,引起腸炎,甚至破裂引起全身性繼發(fā)感染,造成魚體死亡[3]。
本研究將分離菌株進行回歸試驗,發(fā)現(xiàn)新感染斑點叉尾鮰出現(xiàn)相似癥狀,隨后通過與16S rRNA序列與gyrB序列進行比對,確定該病原為嗜水氣單胞菌。斑點叉尾鮰發(fā)病癥狀主要為體色變淡,有褪色斑現(xiàn)象,鰭條基部發(fā)紅,肛門紅腫,脫肛現(xiàn)象較少,內(nèi)臟器官表現(xiàn)為典型的腸道套疊并伴有出血和腸炎跡象,脾臟充血腫大,與嗜水氣單胞菌引起的敗血癥有較大差異,但也有相似之處。這可能與不同嗜水氣單胞菌分離株的毒性、流行水溫及宿主差異有關(guān)[12]。嗜水氣單胞菌導(dǎo)致水產(chǎn)動物致病主要與外分泌物中一些毒力因子有關(guān),包括外毒素和胞外酶[13]。這些毒素和酶往往使被感染魚類發(fā)生不可逆的病變,如溶血素能破壞各種細胞(包括白細胞),腸毒素能引起患病魚腸道細胞損傷,從而導(dǎo)致炎癥及套腸等癥狀。本試驗中,患病斑點叉尾鮰出現(xiàn)腸炎、腸套疊等癥狀,可能與嗜水氣單胞菌攜帶的這些毒力因子有關(guān)。
除此之外,斑點叉尾鮰爆發(fā)性死亡與放養(yǎng)密度和池塘環(huán)境也有關(guān)系。調(diào)查發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖場養(yǎng)殖密度較大,池塘底質(zhì)淤泥較多,池塘底部堆積了大量殘餌糞便,為有害細菌群提供了適宜的生長和繁殖環(huán)境,導(dǎo)致養(yǎng)殖水體偏黃略帶渾濁,池塘中氨氮、亞硝酸鹽含量均嚴(yán)重超標(biāo),最終引起魚體的抵抗力和免疫力下降;同時,該病主要發(fā)生在冷水或涼水水域中(水溫12~19℃)[14]。本次發(fā)病期氣溫突然上升(水溫達到15℃左右),斑點叉尾鮰代謝突然加快,推測可能是本次致病菌感染發(fā)病速度較快的原因之一。后期通過改善水質(zhì),降低了養(yǎng)殖場斑點叉尾鮰的死亡率。
在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中,合理、有效地使用抗生素是治療魚類細菌性疾病的重要措施之一。本試驗對分離菌株進行了藥物敏感性分析,結(jié)果表明,致病菌株對氟苯尼考及氧氟沙星敏感。吳 璇等[4]在研究嗜水氣單胞菌引起的斑點叉尾鮰套腸病時,也發(fā)現(xiàn)該分離菌株對喹諾酮類藥物敏感。喹諾酮類抗生素氧氟沙星已經(jīng)在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中禁止使用,因而臨床上可以選取氟苯尼考治療該疾病。
本試驗通過細菌分離鑒定和人工感染試驗,確定了引起斑點叉尾鮰套腸癥的病原為嗜水氣單胞菌;通過藥敏試驗,得出分離菌株對氟苯尼考和氧氟沙星敏感。試驗結(jié)果可為臨床中由嗜水氣單胞菌引起的斑點叉尾鮰套腸癥的防治提供參考。