應(yīng)用分子標記輔助選育粳稻香型軟米新品系研究

田孟祥 趙 龍 何友勛 張時龍 余本勛 葉永印

（畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，貴州畢節(jié) 551714）

水稻是我國主要的糧食作物之一，是我國大部分人口的主要食物來源[1]。隨著人們生活水平的改善，對稻米品質(zhì)的要求也不斷提高，由“吃得飽”向“吃得好”轉(zhuǎn)變，而“吃得好”主要體現(xiàn)在優(yōu)良食味。軟米是一種優(yōu)良食味大米，直鏈淀粉含量較低，介于一般糯米與黏米之間，蒸煮的米飯具有晶瑩剔透、爽口舒適、冷后不回生不變硬等優(yōu)點[2]，深受消費者歡迎。香米因其具有獨特的芳香氣味，備受青睞。因此，培育含軟米和香味2種類型基因的優(yōu)良食味水稻品種以滿足市場和消費者的需求，已成為水稻育種中最重要的研究目標。

水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq、甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2分別作為控制軟米和香味的重要基因之一，在育種中被廣泛利用。然而，同時含有以上2種基因的新品種卻并不多見。本研究將含Badh2基因的育種中間材料DHX611（母本）與含Wx-mq基因的南粳9108（父本）進行組配雜交，結(jié)合分子標記輔助選擇，選育出含以上2種目標基因的香型軟米新品系香軟粳7002，經(jīng)初步鑒定表現(xiàn)良好，為下一步的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，也豐富了貴州省粳稻香型軟米的育種實踐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DHX611：母本，水稻育種中間材料，為稻花香2號和畢粳611的雜交后代，遺傳性狀已穩(wěn)定，含來源于稻花香2號的香味基因Badh2。

南粳9108：父本，引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，為優(yōu)良食味軟米品種，含低直鏈淀粉基因Wx-mq[3]。

1.2 試驗方法

1.2.1 香型軟米新品系香軟粳7002的選育。2014年正季以自育水稻育種中間材料DHX611為母本，以引進的南粳9108為父本進行雜交，獲得F1；同年冬繁種植于海南三亞，后經(jīng)貴州畢節(jié)與海南三亞兩地多年交替加代選育而成。根據(jù)育種目標，從F2開始，每個世代選農(nóng)藝性狀較好的單株，結(jié)合Wx-mq、Badh2這2個基因分子標記鑒定，選留農(nóng)藝性狀好且含以上2個目標基因的單株，于2020年選育成香型軟米新品系，暫定名為香軟粳7002。

1.2.2 軟米基因和香味基因分子標記鑒定。這2個基因的主要鑒定步驟如下。

（1）水稻葉片取樣。在分蘗期，將各單株水稻編號，取其新鮮葉片2～3片，放入4號自封袋中，保存在-20℃冰箱中冷凍備用。

（2）水稻葉片研磨。DNA提取時葉片研磨參照田孟祥等[4]的烘干法進行制備，取先前存于冰箱冷凍的水稻葉片約0.4 g，放入2 mL的離心管中，然后將該離心管置于鼓風(fēng)干燥箱中進行干燥，干燥箱溫度設(shè)置為60℃，烘烤時間為24 h；取出離心管，放在離心管架上固定，用塑料研磨棒伸入離心管內(nèi)，上下來回敲擊葉片，攪碎成粉狀。

（3）水稻DNA的提取。向裝有已粉碎葉片的離心管中加入1.5 mL的溫?zé)酑TAB提取液（2%的CTAB，100 mmol/L 的 Tris-HCl，20 mmol/L 的 EDTA，1.4 mmol/L的NaCl），65℃水浴1 h，期間搖勻數(shù)次；在轉(zhuǎn)速12 000 r/min條件下離心10 min，回收上清液0.9 mL于2 mL離心管；加入24∶1氯仿異戊醇溶液0.9 mL，震蕩 15 min；在轉(zhuǎn)速12 000 r/min條件下離心10 min，小心吸取上清液0.5 mL于1.5 mL離心管；加入 0.05 mL的 NaAC（3 mol/L）和 0.9 mL的-20℃無水乙醇，混勻，置于-20℃冰箱中靜置5 h以上甚至過夜；在轉(zhuǎn)速12 000 r/min、冷凍離心機-10℃條件下離心10 min，倒出廢液；將離心管放在超凈工作臺上風(fēng)干，加入去離子水溶解DNA備用。

（4）軟米基因Wx-mq分子鑒定。參照陳 濤等[5]的方法，該標記由4條引物組成，即：

Wx-mq-O-F：5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTT GCAGGC-3'；

Wx-mq-O-R：5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTT TCCCCAA-3'；

Wx-mq-I-F：5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCT ACAATCG-3'；

Wx-mq-I-R：5'-GTCGATGAACACACGGTCGA CTCAAT-3'。

反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性 30 s、65℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用瓊脂糖凝聚電泳檢測，參照田孟祥等[6]的方法進行。

（5）香味基因Badh2分子鑒定。參照陸艷婷等[7]的方法，略有修改，標記由4條引物組成，即：

ESP：5'-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3'；

EAP：5'-AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-3'；

IFAP：5'-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3'；

INSP：5'-CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3'。

反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及產(chǎn)物檢測參照上述軟米基因Wx-mq分子鑒定方法進行，但退火溫度改為57℃。以上所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 調(diào)查內(nèi)容與方法

水稻農(nóng)藝性狀考查按照《國家水稻品種試驗觀察記載項目、方法及標準（試行）》進行，主要考查產(chǎn)量、株型、生育期、株高及穗粒性狀等參數(shù)指標。

稻谷收獲后，陰干，除雜，取300 g送至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）進行稻米品質(zhì)指標檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟米基因Wx-mq的分子檢測鑒定

采用陳 濤等[5]設(shè)計的Wx-mq基因功能標記對目的基因進行檢測，該功能標記基于單核苷酸突變的擴增受阻突變體系PCR技術(shù)，由4條引物組成，內(nèi)、外引物各2條，即正向外引物Wx-mq-O-F、反向外引物Wx-mq-O-R、正向內(nèi)引物Wx-mq-I-F、反向內(nèi)引物Wx-mq-I-R。根據(jù)設(shè)計原理和引物所處的DNA序列位置，所有的水稻植株均能擴增出片段大小為439 bp的條帶，在含純合軟米Wx-mq基因的水稻植株可擴增出片段大小為292 bp的特征條帶，在普通不含Wx-mq基因的水稻植株可擴增出片段大小為200 bp的特征條帶，而雜合基因型則擴增出以上3種條帶類型。在香軟粳7002的選育過程中，從F2開始，對農(nóng)藝性狀較好的單株，利用Wx-mq基因功能標記對目的基因進行檢測鑒定，選擇含純合和雜合目的基因的植株繼續(xù)下一代的種植，如此重復(fù)鑒定，直至性狀遺傳穩(wěn)定。Wx-mq基因功能標記對F2的檢測情況如圖1所示。

從圖1可以看出，在F2群體的泳道4、8、16擴增出片段大小為439bp和292bp條帶，與在泳道1的親本南粳9108的擴增帶型一致，為含純合Wx-mq基因植株；泳道 5、6、10、11、15、17、18 擴增出片段大小為439bp和200bp條帶，與在泳道2的親本DHX611的擴增帶型一致，為不含Wx-mq基因植株；而泳道7、9、12、13、14 擴增出以上所有條帶類型，與在泳道3的F1植株的擴增帶型一致，為含雜合Wx-mq基因植株。

根據(jù)育種目的，僅保留含純合和雜合Wx-mq基因植株的種子，下一步繼續(xù)進行鑒定，其他不含目的基因的植株進行舍棄處理。

2.2 香味基因Badh2的分子檢測鑒定

對已確定含Wx-mq基因的植株，再利用陸艷婷等[7]報道的香味基因Badh2功能標記對該香味基因進行檢測，該功能標記由4條引物組成，即引物ESP、引物EAP、引物IFAP以及引物INSP。根據(jù)引物所在DNA序列的位置，由引物ESP和EAP擴增出的大小為580 bp左右的條帶（非香稻為585 bp，香稻為577 bp）在每個植株樣品中均呈現(xiàn)，主要起到陽性對照的作用，同時它也可以有效地降低非特異PCR產(chǎn)物的擴增和引物二聚體的形成[8]；在含純合香味基因Badh2的水稻植株中能擴增出257 bp大小的條帶，在不含香味基因Badh2的植株中擴增出355 bp大小的條帶，而雜合基因型則擴增出以上3種條帶類型。香味基因Badh2功能標記對F2植株的檢測情況如圖2所示。

在 F2群體檢測圖譜中，泳道 4、7、12、16 擴增出的帶型與在泳道1的親本南粳9108一致，擴增出大小約為580 bp和355 bp條帶，為不含香味基因Badh2 的水稻植株； 泳道 6、8、10、13、17、18 擴增出的帶型與在泳道2的親本DHX611一致，擴增出大小約為580 bp和257 bp條帶，為含純合香味基因Badh2的水稻植株；而泳道5、9、14、15擴增出的條帶與在泳道3的F1帶型一致，擴增出以上3種帶型條帶，為含雜合香味基因Badh2的水稻植株。不含目的基因的水稻植株種子在本輪鑒定中淘汰，反之繼續(xù)下一代的選擇與鑒定。其他世代目標基因檢測也按上述檢測鑒定方法，不再另敘。

2.3 農(nóng)藝性狀

經(jīng)過考查，香軟粳7002株型較緊湊，分蘗力較強，葉色淡綠，葉姿較挺，彎曲穗，抗倒性較強，后期熟相好，平均產(chǎn)量為8 034 kg/hm2，全生育期163 d，株高102.8 cm，有效穗288萬穗/hm2，穗長18.7 cm，穗總粒數(shù)167.3粒，結(jié)實率93.2%，千粒重26.8 g，綜合農(nóng)藝性狀好。

2.4 稻米品質(zhì)

經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）檢測，香軟粳7002的出糙率為82.1%，精米率為72.9%，整精米率為63.0%，粒長5.5 mm，長寬比2.0，堊白粒率18.0%，堊白度2.5%，直鏈淀粉含量11.8%，膠稠度90 mm，堿消值7.0級，透明度1級，氣味為香。由檢測指標可見，水稻香軟米7002除具有香味和低直鏈淀粉特性外，堊白粒率和堊白度都較低，展現(xiàn)出良好的外觀品質(zhì)，商業(yè)價值潛力較高。

2.5 香軟粳7002的有機種植表現(xiàn)

隨著人們生活水平的不斷改善，對于稻米，不再僅限于“好吃”，也更加關(guān)注于“吃得健康”。香軟粳7002兼具香和軟的特性，爽口舒適，食味優(yōu)良，應(yīng)用前景好。

為滿足人們“好吃”和“吃得健康”的需要，2021年正季，在自然生態(tài)條件良好的貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)田壩鎮(zhèn)開展了香軟粳7002有機種植試驗。在試驗種植過程中，除底肥施用農(nóng)家肥外，全程未施用農(nóng)藥和化肥。根據(jù)調(diào)查，在此種植方式下，除分蘗力相對較弱外，其他農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)較好，生育期適中，根系吸收能力強，籽粒飽滿，結(jié)實率高，熟相好，產(chǎn)量較高，達7 242 kg/hm2，推廣潛力看好。香軟粳7002有機種植試驗的田間表現(xiàn)如圖3所示。

3 結(jié)論與討論

軟米蒸煮的米飯具有質(zhì)地柔軟、滋潤爽口等特性，適口性好，食味佳，頗受消費者歡迎。我國最早種植軟米的區(qū)域主要為西南地區(qū)，尤其是云南，典型的品種為毫屁、毫民等，曾在古代列為宮廷貢品，之后更是被列為國家級優(yōu)質(zhì)上等米[9]。從有關(guān)文獻報道來看，20世紀80年代提出的低直鏈淀粉含量育種目標，成為軟米研究發(fā)展的起始點[10]。

隨著社會的進步與發(fā)展，人們對軟米的需求日益增加，軟米新品種的選育已成為許多水稻育種工作者重要的育種目標。近年來，在水稻育種工作者的不斷努力下，我國多個省份新的軟米品種不斷呈現(xiàn)，選育出南粳 46[11]、云粳 20 號[12]、南粳 5055[13]、南粳9108[14]、豐粳 1606[15]、南粳 5718[16]、銀香 38[17]等一系列軟米品種，在一定程度上滿足了種植者和消費者的需求。

香稻具有一種特殊氣味性狀，頗受人們偏愛，也一直是育種者關(guān)注的重點。

在現(xiàn)代育種技術(shù)日益發(fā)展的今天，分子標記輔助選擇已經(jīng)成為水稻育種的一個重要輔助手段，具有不受環(huán)境條件影響和選擇效率高等優(yōu)勢，頗受育種者青睞[18]。目前，貴州省尚未有自育粳稻香型軟米品種的報道，外來品種多出現(xiàn)“水土不服”現(xiàn)象，難以適應(yīng)貴州省特殊的山地高原氣候條件。筆者所在的育種團隊基于貴州省特殊的氣候生態(tài)條件，引進省外含軟米Wx-mq基因的水稻品種南粳9108與育種中間材料DHX611進行組配雜交，采用傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀選擇與分子標記輔助選擇相結(jié)合的方法，選育成了粳稻香型軟米新品系香軟粳7002，豐富了貴州省粳稻香型軟米育種實踐。經(jīng)初步試驗鑒定，香軟粳7002表現(xiàn)良好，下一步將擴大鑒定范圍，以便收集更多數(shù)據(jù)為科學(xué)指導(dǎo)其應(yīng)用提供重要參考。