基于KASP技術的SNP標記用于西瓜品種指紋圖譜構建和種子純度檢測

劉 欣， 程 瑞， 徐兵劃， 白 甜， 許文釗， 張朝陽， 羅德旭， 趙建鋒， 張興平，孫玉東

(江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所/淮安市設施蔬菜重點實驗室,江蘇淮安223001)

隨著測序技術的進步，分子標記技術在遺傳與育種研究中的應用越來越普及。已有分子標記主要分為四大類：(1)基于DNA-DNA雜交的分子標記，比如RFLP標記；(2)基于PCR的分子標記，比如RAPD標記、SCAR標記和SSR標記等；(3)基于PCR與限制性酶切技術結合的分子標記，比如AFLP標記和CAPS標記；(4)基于單核苷酸多態(tài)性的分子標記，比如SNP標記。其中SNP標記分布廣、多態(tài)性高、可靠性高，在遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建和分子標記輔助選擇等方面被廣泛應用[1-6]。競爭性等位基因特異性PCR (Kompetitive allele specific PCR，KASP) 是一種新型高通量SNP分型技術，該技術準確度高,可以實現(xiàn)自動化操作，簡單便捷，并且將使用SNP標記的成本降至最低[7]，是目前最理想的基因分型技術。

指紋圖譜是指利用DNA分子標記對作物品種進行檢測，并根據(jù)不同品種的每個標記的基因型而建立的圖譜，據(jù)此可以有效避免品種的同名異物及同物異名的問題，有利于種業(yè)的健康發(fā)展。目前，已有許多品種利用基于KASP技術的SNP標記完成了指紋圖譜的構建。王富強等[8]利用KASP技術將22個高質量SNP標記用于76份葡萄品種的指紋圖譜構建。李志遠等[4]利用篩選獲得的50個核心SNP標記，構建了59份市場上主要推廣的甘藍品種指紋圖譜。魏慶鎮(zhèn)等[9]篩選了34個高質量SNP標記，并構建了6個浙茄品種的指紋圖譜。目前，在西瓜中，大部分種質資源及品種的指紋圖譜由SSR標記構建[10-12]，其缺點是多態(tài)性低，操作步驟繁瑣，不能實現(xiàn)自動化，對于大批量樣品檢測，耗費時間長，人工成本高。因此，建立基于KASP技術的SNP標記用于西瓜品種鑒定和種子純度檢測是非常必要的。

本研究利用Yang 等[6]開發(fā)的32個核心SNP標記，采用KASP技術對79份西瓜雜交種及自交系材料進行基因分型，根據(jù)分型數(shù)據(jù)以及多態(tài)性信息，篩選獲得30個核心SNP標記，用于構建蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種的指紋圖譜，同時，篩選出具有多態(tài)性和分型較好的標記，用于種子純度檢測，為鑒定西瓜品種的真實性提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的試驗材料如表1所示。每份材料播種5粒于72孔穴盤中，放置于25 ℃、16 h(光)/8 h(暗)環(huán)境中，正常水肥管理，保證出芽和成苗。待幼苗長出2～3片真葉時，取嫩葉0.1 g于1.5 ml離心管中，用于提取DNA進行PCR反應。種子純度檢測所用的蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號、蘇夢9、蘇創(chuàng)3號、蘇創(chuàng)4號和蘇創(chuàng)5號西瓜種子均取自制種棚，制種參考西瓜雜交制種技術[13]，隨機選取收獲的雜交種子90粒播種于穴盤，編號Z1～Z90，待2片真葉展平后取1片真葉于1.5 ml離心管中，用于提取DNA進行PCR反應，待幼苗伸蔓后，按照每個雜交種的編號(Z1～Z90)定植在塑料大棚中，行距2.6 m，株距30.0 cm，爬地栽培，正常水肥管理，待結果后進行田間純度鑒定。

表1 供試西瓜種質資源

1.2 DNA提取

將取好的樣品放入液氮罐中速凍，用組織研磨器[天根生化科技(北京)有限公司產品]研磨至粉末狀，采用北京華越洋生物科技有限公司提供的試劑盒(0418-50BB型)提取DNA，最后用蒸餾水洗脫和溶解DNA。取2 μl DNA用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，無拖帶且條帶單一即可進行下一步試驗。利用Nanodrop 2000測定吸光值OD260/OD280及OD260/OD230，測定值為1.8～2.0時表示DNA質量較好。測定每份DNA樣品的濃度，并稀釋質量濃度至60 ng/μl進行PCR反應。

1.3 PCR反應

根據(jù)Yang 等[6]開發(fā)的40個核心SNP標記信息合成引物，在每組引物中的正向引物(Forward 1)的序列5′端加上接頭序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在正向引物(Forward 2)序列的5′端加上接頭序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，反向引物序列不用改變，用蒸餾水溶解稀釋引物濃度至100 μmol/L，按照如下體系配置引物混合物(Primer Mix)：正向引物Forward1和Forward2各12 μl，反向引物30 μl，加蒸餾水至100 μl，配置完成后保存于-20 ℃?zhèn)溆?。每個PCR反應孔的體系配置如下：DNA模板1.20 μl，Primer Mix 0.14 μl，2×KASP Mix(北京嘉程生物科技有限公司產品)5.00 μl，蒸餾水3.50 μl，配置完成后封膜，每個96孔反應板中加入2個陰性對照(NTC)。PCR反應板和封板膜由愛思進生物技術(杭州)有限公司提供。將加樣完成的PCR板放入熒光定量檢測儀器(Applied Biosystems /7500型定量PCR儀)中進行熒光定量PCR反應，反應程序如下：94 ℃預變性15 min; 94 ℃變性20 s，61～55 ℃復性和延伸1 min， 10個循環(huán)，每循環(huán)一次降低0.6 ℃; 94 ℃變性20 s，55 ℃繼續(xù)擴增60 s ，26個循環(huán)。PCR反應結束后讀取數(shù)據(jù)，若分型不充分，則繼續(xù)擴增，每3個循環(huán)查看分型情況，不超過40個循環(huán)。

1.4 KASP基因分型

熒光定量PCR結束后，使用Real-Time PCR Software V2.4軟件進行分型及分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

根據(jù)引物信息、熒光信號和分型結果，統(tǒng)計每個SNP位點基因型。聚類分析采用MEGA X軟件版本，將位點信息轉化為序列信息，運用近鄰法(Neighbor-Joining method)和JTT矩陣模型來進行計算[14-15]，重復計算次數(shù)為1 000次。

2 結果與分析

2.1 KASP分型

根據(jù)KASP的分型結果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結果(圖1 )顯示，用32個核心標記對所有材料進行KASP分型，有2個標記分型失敗，分別是WmSNP178和WmSNP192。其余30個標記雖然在所有材料中存在分型數(shù)據(jù)缺失的情況，但每個材料缺失標記數(shù)量都不超過3個，因此，這30個標記能夠成功分型(圖1 )，用于遺傳背景分析和指紋圖譜構建。標記WmSNP47在大部分材料中是雜合位點，雜合基因型占比87.5%。標記WmSNP151在所有材料中均是純合位點，基因型為C或者T。

A：標記WmSNP140在79份材料中的基因分型；B：標記WmSNP92在蘇創(chuàng)4號種子純度檢測中的基因分型。FAM、VIC表示探針的熒光值。

2.2 遺傳背景分析

根據(jù)KASP分型結果，我們將熒光信號轉換成不同位點的基因型，運用MEGA軟件對79份材料進行進化樹分析，結果見圖2。蘇夢系列小果型品種蘇夢2號(Wm38)、蘇夢5號(Wm21)、蘇夢6號(Wm40)、蘇夢7號(Wm31)被聚類在一個分支上，屬于一個類型，說明這些品種遺傳關系相近，而在人工選育時，這些品種選擇的育種方向都是紅瓤，中心糖度高，果皮韌性較強，耐裂[16]，并且蘇夢5號、蘇夢6號和蘇夢7號的父本相同，因此這3個品種在遺傳背景上具有相似性。Wm13和Wm14是2個野生種，與雜交種在性狀上存在較大差異：野生種瓤色為白色，且具有苦味，種子顏色為灰綠色無覆紋或紅褐色有斑點狀覆紋，與雜交種種子的棕色和黑色不同。從圖2中可以看出，其與蘇夢系列品種親緣關系較遠，分屬不同分支，屬于不同類型。蘇夢3號(Wm39)與蘇夢4號(Wm16)分別屬于不同分支，二者瓤色不同，前者為紅瓤，后者為黃瓤，且蘇夢4號果肉風味獨特，推測二者在某些位點具有遺傳多樣性。蘇夢9號(Wm22)與蘇夢6號(Wm40)也屬于不同分支，蘇夢6號果皮覆紋形狀為窄齒條狀，而蘇夢9號齒條較寬，并且其果形比蘇夢6號稍大。蘇夢7號親本Wm29和Wm33的遺傳距離為0.43，二者遺傳距離較遠，農藝性狀測定結果顯示其雜交一代蘇夢7號的品質高于雙親，尤其是在果皮韌性方面，其雙親果皮分別為易裂和中等硬度，但蘇夢7號表現(xiàn)出韌性強的特點[16]。

圖中的材料見表1。方框中的材料表示2個野生種材料；帶星號的材料表示蘇夢7號的親本。

2.3 指紋圖譜構建

我們利用KASP分型成功的SNP 標記構建了蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種的指紋圖譜，位點和基因型數(shù)據(jù)如表2所示。在30個SNP標記中，WmSNP162在15份西瓜品種中基因型(GG)全部一致，為純合位點。WmSNP226在蘇夢8號中的基因型(AG)為雜合，其他品種該位點基因型均為純合(AA)。WmSNP92在蘇夢8號中是純合基因型(CC)，在蘇夢1號中未檢出，其余品種該位點基因型(TC)均為雜合。通過WmSNP1、WmSNP29、WmSNP60、WmSNP66、WmSNP140和WmSNP156共6個SNP標記即可將所有蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種區(qū)分開。根據(jù)位點基因型信息，將每個品種指紋圖譜轉化為二維碼，方便品種的真實性鑒定和推廣(圖3)。

圖3 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種指紋圖譜二維碼

表2 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種指紋圖譜

2.4 種子純度檢測

根據(jù)KASP分型結果，篩選可以對蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號、蘇夢9號、蘇創(chuàng)3號、蘇創(chuàng)4號和蘇創(chuàng)5號西瓜品種種子進行純度檢測的標記。結果顯示，標記WmSNP5在蘇創(chuàng)3號的雙親中是純合位點，且呈現(xiàn)多態(tài)性，在蘇創(chuàng)3號中是雜合位點，可以用來對蘇創(chuàng)3號種子的純度和真實性進行檢測。利用同樣的分析方法，我們篩選到標記WmSNP92可以用來檢測蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號、蘇夢9號、蘇創(chuàng)4號、蘇創(chuàng)5號6個西瓜品種種子的純度(圖1 B)。通過標記WmSNP5和WmSNP92，利用KASP技術對上述7個西瓜品種進行種子純度鑒定，同時進行田間種植鑒定，鑒定指標包括葉片形態(tài)、果皮花色、果型、種子大小及顏色等，結果如表3所示，田間鑒定結果與分子標記鑒定結果一致，因此，標記WmSNP92和WmSNP5可用于蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號、蘇夢9號、蘇創(chuàng)4號、蘇創(chuàng)5號和蘇創(chuàng)3號種子純度和真實性的檢測。

表3 蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜品種種子純度鑒定結果

3 討論與結論

對于育種工作者來說，明確種質資源和育種材料的遺傳背景,鑒定商品品種種子純度及種子的真實性非常重要，傳統(tǒng)的鑒定方法主要是從植株表型觀察鑒定。隨著分子生物學和基因組學的發(fā)展，人們開發(fā)的分子標記可以在基因水平上直接反映植物的遺傳多態(tài)性，因此分子標記已經成為植物遺傳多樣性研究的主要方法[17-19]。KASP技術是目前最為經濟有效的SNP標記分型技術[20]。利用以KASP技術為基礎的SNP標記研究種質資源的遺傳背景，構建品種指紋圖譜以及鑒定品種的真實性是未來發(fā)展的趨勢。馮子珊等[21]通過KASP技術，對浙蒲9號父本、母本以及92份F1材料進行基因分型，進而鑒定F1材料的種子純度，結果與田間種子純度鑒定結果一致，且該方法準確性高，成本低。Shen等[22]利用SNP標記對372份青花菜種質的遺傳多樣性和親緣關系進行了分析與評價，最終篩選出28個KASP標記對青花菜種質進行基因分型，用于種子鑒定和品種鑒定。Mulugeta等[23]利用37個基于KASP技術的SNP標記對48個埃塞俄比亞蠶豆進行了遺傳多樣性和親緣關系的分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳多態(tài)性較高，有利于培育優(yōu)良品種。

本研究利用32個核心SNP標記對79份西瓜材料(包括54份自交系和25份F1雜交種)進行KASP分型和遺傳背景分析，通過聚類分析及遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)，不同自交系間的遺傳距離不同，因此，我們可以通過選擇遺傳距離較遠的自交系進行雜交配組，篩選高優(yōu)勢組合，進而為選育優(yōu)質和高優(yōu)勢品種奠定基礎。通過分析我們還發(fā)現(xiàn)蘇夢系列不同品種其遺傳背景有差異，這也從DNA水平上解釋了不同品種間性狀差異的原因。但是在進行KASP分型時，有2個標記分型不成功，推測這是因為79份材料不能涵蓋西瓜的所有品種，這2個位點基因型不呈現(xiàn)多態(tài)性，因此導致分型失敗。本研究針對蘇夢和蘇創(chuàng)系列西瓜，利用篩選出來的30個SNP標記構建指紋圖譜，為西瓜品種鑒定和保護提供了技術支撐。通過篩選出來的WmSNP5和WmSNP92標記，對江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所培育的蘇夢5號、蘇夢6號、蘇夢7號、蘇夢9號、蘇創(chuàng)3號、蘇創(chuàng)4號、蘇創(chuàng)5號7個西瓜品種[24-26]進行種子純度鑒定，構建了以KASP技術為基礎的種子純度檢測體系，具有高效、簡單、便捷等特點，方便了種子生產銷售中種子純度的鑒定。

致謝:感謝中國計量大學徐沛研究員對本論文提供指紋圖譜構建方面的幫助！