高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)扶正救肺顆粒的質(zhì)量

郭燕，孫嵐萍，顧志榮，楊浩，葛斌（.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000）

扶正救肺顆粒是甘肅省人民醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，益氣、健脾、活血是其基本治法，由黃芪、炒白術(shù)、生地、當(dāng)歸等14 味藥物組成。方中黃芪[1]、白術(shù)[2]補(bǔ)正氣之虛為君藥；北沙參[3]、麥冬、地黃養(yǎng)陰清肺為臣藥；丹參[4]、川芎[5]、當(dāng)歸[6]等活血化瘀為佐藥；甘草補(bǔ)脾益氣為使藥。具有清熱活血、益氣的功效，治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化療效顯著[7]，目前已在臨床應(yīng)用十余年。扶正救肺顆粒由14 味中藥提取而成，其有效成分復(fù)雜多樣，僅對(duì)單一成分進(jìn)行定量分析，難以全面、真實(shí)地評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量。王智民等[8]率先提出一測(cè)多評(píng)法（QAMS），利用中藥及復(fù)方制劑中的一種成分的對(duì)照品作為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分之間的相對(duì)校正因子，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其他成分含量，來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在中藥復(fù)方制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)中得以推廣應(yīng)用[9-11]。本研究在建立HPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照物，應(yīng)用QAMS 測(cè)定扶正救肺顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素4 種成分的含量，為全面、準(zhǔn)確地控制和評(píng)價(jià)扶正救肺顆粒的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

十萬(wàn)分之一Sartorius BT 125D 型精密電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；HH-4 型數(shù)顯水浴鍋（西安超杰儀器有限公司）；SB25-12DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；島津LC-16 型高效液相色譜儀（島津儀器有限公司）；YC-1000 實(shí)驗(yàn)室噴霧制粒包衣機(jī)（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

黃芪、炒白術(shù)、北沙參、地黃、麥冬、丹參、川芎、當(dāng)歸、陳皮、桔梗、瓜蔞、紫菀、款冬花、甘草14 味中藥飲片（甘肅隴脈藥材有限公司，經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院鄭秀麗副主任中藥師鑒定）；橙皮苷（批號(hào)：110721-201316）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：CHB171102）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：CHB171103）、芒柄花素（批號(hào)：CHB171026）對(duì)照品（純度≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；乙腈、甲酸為色譜純（天津大茂有限公司）；其余試劑均為分析純；扶正救肺顆粒（甘肅省人民醫(yī)院制劑室制備，編號(hào)：S1～S15，規(guī)格：15 g/袋）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 反相WondaSil C18-WR 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，8%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～40 min，20%～40%A；40～50 min，40%～55%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷、芒柄花素對(duì)照品適量，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.9520、0.1596、2.5080、0.0532 mg·mL－1混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取10 g 樣品，置包有遮光紙的具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲60 min，3000 r·min－1離心10 min，取上清液，溶劑回收至干，以甲醇定容至5 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。按最佳工藝[12]制得缺地黃、黃芪、陳皮的陰性樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）、樣品（B）、缺地黃陰性樣品（C）、缺黃芪陰性樣品（D）、缺陳皮陰性樣品（E）HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference（A），sample（B），negative sample without Rehmanniae Radix（C），negative sample without Astragali Radix（D），and negative sample without Citri Reticulatae Pericarpium（E）

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋系列成系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度X（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab 1 Linearity of various constituents

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的峰面積RSD分別為0.37%、0.75%、0.53%、0.44%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液6 份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素含量RSD分別為0.32%、0.85%、0.37%、1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1 號(hào)供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的峰面積RSD分別為3.0%、2.6%、2.0%、1.6%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的扶正救肺顆粒6 份，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，分別加入一定量的對(duì)照品溶液（1∶0.5、1∶1、1∶1.5），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、橙皮苷和芒柄花素的平均回收率分別為100.11%、100.45%、99.38%、100.28%，RSD分別為1.4%、2.0%、0.79%、2.1%。

2.2 指紋圖譜

2.2.1 指紋圖譜共有模式的建立 取15 批扶正救肺顆粒（S1～S15）樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012年版進(jìn)行分析，通過(guò)檢測(cè)得到的共有峰與混合對(duì)照品保留時(shí)間對(duì)比指認(rèn)了4 個(gè)成分，分別是13 號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷、14 號(hào)峰毛蕊花糖苷、17 號(hào)峰橙皮苷、24 號(hào)峰芒柄花素，保留時(shí)間分別為22.578、23.786、26.484、44.683 min。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品（A）和代表性樣品（B）HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC of mixed reference substance（A）and representative sample（B）

2.2.2 14 味處方藥材溶液的制備 分別稱(chēng)取黃芪、炒白術(shù)、北沙參、地黃、麥冬、丹參、川芎、當(dāng)歸、陳皮、桔梗、瓜蔞、紫菀、款冬花、甘草適量，粉碎，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備每味藥材的供試品溶液。

2.2.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)與聚類(lèi)分析 以S1扶正救肺顆粒指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，繪制15 批顆粒的指紋圖譜，見(jiàn)圖3。指紋圖譜共確定24 個(gè)共有峰，將13 號(hào)峰作為指紋圖譜為參照峰；通過(guò)保留時(shí)間及紫外光譜確定了其中5 個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的成分，分別是阿魏酸（12 號(hào)峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（13 號(hào)峰）、毛蕊花糖苷（14 號(hào)峰）、橙皮苷（17 號(hào)峰）及芒柄花素（24 號(hào)峰）。計(jì)算15 批扶正救肺顆粒指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。15批供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均＞0.92，表明制備工藝所得的顆粒質(zhì)量穩(wěn)定、均一。

表2 15 批扶正救肺顆粒指紋圖譜的相似度Tab 2 Similarity of fingerprints of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

圖3 15 批扶正救肺顆粒HPLC 指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprints of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

將15 批扶正救肺顆粒的共有峰峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，聚類(lèi)方法為“最短距離法”，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)距離為10 時(shí)，除S1、S2 外，其余13 批樣品被分為一類(lèi)，進(jìn)一步說(shuō)明不同批次顆粒質(zhì)量穩(wěn)定、均一。聚類(lèi)結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致，S1、S2 相似度較小。

圖4 15 批扶正救肺顆粒聚類(lèi)樹(shù)狀分析圖Fig 4 Cluster dendrogram of 15 batches of Fuzheng Jiufei granules

2.2.4 共有峰的歸屬 取14 味藥材的供試品溶液，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，通過(guò)各單味藥的色譜峰保留時(shí)間及紫外光譜，分析各色譜峰的藥材來(lái)源，結(jié)果見(jiàn)圖5及表3。

表3 共有峰的來(lái)源Tab 3 Sources of common peak

圖5 扶正救肺顆粒HPLC 指紋圖譜共有峰藥材歸屬Fig 5 Common peak attribution in fingerprints of Fuzheng Jiufei granules

2.3 一測(cè)多評(píng)法

2.3.1 相對(duì)校正因子 以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)，按公式計(jì)算其他3 種成分的相對(duì)校正因子，（fs/k）＝fk/fs＝（CsAk）/（CkAs）（Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物峰面積，Ck為待測(cè)成分質(zhì)量濃度，Ak為待測(cè)成分峰面積），結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.2 樣品測(cè)定 取5 批扶正救肺顆粒制備供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，采用外標(biāo)法（ESM）同時(shí)測(cè)定4 種成分的含量，用QAMS 法建立各待測(cè)物的相對(duì)校正因子測(cè)定3 種待測(cè)成分量，比較2 種方法測(cè)定結(jié)果的差異。結(jié)果2 種方法所測(cè)得各成分的含量基本一致，相對(duì)平均偏差（RAD）＜2.0%，結(jié)果見(jiàn)表5。表明QAMS 可用于扶正救肺顆粒中4 個(gè)化學(xué)成分的含量測(cè)定。

表5 QAMS 法與EMS 法測(cè)定扶正救肺顆粒各成分的含量Tab 5 Content of components in Fuzheng Jiufei granules by QAMS method and ESM method

3 討論

黃芪作為該方君藥，內(nèi)能補(bǔ)脾肺之氣，外可固表止汗，主要化學(xué)成分為多糖、黃酮、皂苷等，黃芪中的總黃酮有抑制肺纖維化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）作用[13]。橙皮苷為陳皮主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷具有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[14-15]，可抑制肺成纖維細(xì)胞活化[16]。同時(shí)，張慧等[17]發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷對(duì)于內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷有保護(hù)作用。因此，選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、芒柄花素和橙皮苷4 種成分作為扶正救肺顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

檢測(cè)了不同波長(zhǎng)下（220、280、300 nm）的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm 時(shí)，基線(xiàn)平穩(wěn)，各峰形較好，標(biāo)定出24 個(gè)共有峰，能較多地反映出扶正救肺顆粒的內(nèi)在質(zhì)量信息。

QAMS 法和外標(biāo)法測(cè)得毛蕊花糖苷、芒柄花素和橙皮苷含量的偏差均不高于2.0%，測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，表明QAMS 法準(zhǔn)確且可靠。在含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，建立指紋圖譜，15 批樣品指紋圖譜相似度均在0.92 以上，表明不同批次樣品的化學(xué)成分具有較好的一致性。

指紋圖譜技術(shù)具有模糊性、整體性和專(zhuān)屬性，能全面反映扶正救肺顆粒的內(nèi)在化學(xué)特征[18]；同時(shí)，選取4 種活性成分進(jìn)行QAMS 法多指標(biāo)定量，可在缺少對(duì)照品的條件下以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確定量其他組分，降低了分析檢測(cè)成本。本研究將指紋圖譜和QAMS 法相結(jié)合，既考察了樣品中多個(gè)指標(biāo)性成分的含量，又考察了其指紋圖譜整體相似度，建立的分析方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好[19]，為扶正救肺顆粒質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了一定的參考。