丹參酮ⅡA調(diào)控子宮炎性微環(huán)境改善著床障礙大鼠著床窗期子宮內(nèi)膜容受性的研究

崔靜靜，劉芳，張燕，曹平，馬燕*

(1.河北省故城縣醫(yī)院，衡水 253800；2.河北省井陘縣醫(yī)院，石家莊 050399；3.河北省黃驊市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，滄州 061200)

胚胎植入功能障礙已成為妊娠成功的瓶頸因素[1]。有數(shù)據(jù)表明，導(dǎo)致妊娠失敗的主要原因是胚胎著床障礙，在人類中其發(fā)生率高達(dá)78%[2]。子宮內(nèi)膜容受性是指母體子宮內(nèi)膜在特定時間接受胚胎著床的能力，這個時期被稱為“著床窗口期”[3]。成功的胚胎植入的先決條件是胚胎發(fā)育必須與子宮內(nèi)膜容受性之間同步化[4]。因此，通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜容受性的建立來改善胚胎著床是治療不孕癥的臨床突破之一。有動物實驗表明，子宮內(nèi)膜可以接受囊胚著床的時間段是有限的，在嚙齒動物中只能持續(xù)幾個小時[5]。人體著床窗口主要在月經(jīng)周期的第20天和第21天之間，這與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面的胞飲突出現(xiàn)時間較一致[6]；且胞飲突的數(shù)量與胚胎著床效力呈正相關(guān)，因此，胞飲突被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性的超微結(jié)構(gòu)標(biāo)志物[7]。

人類胚胎著床涉及與囊胚侵入蛻膜相關(guān)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。胚胎需要突破子宮內(nèi)膜上皮著床，建立母體子宮-胎盤血液循環(huán)。妊娠的結(jié)果取決于母體子宮微環(huán)境調(diào)節(jié)炎癥過程和建立母體耐受性的能力[8]。人們普遍認(rèn)為，在懷孕早期，為了成功著床需要一個受調(diào)節(jié)的促炎微環(huán)境，允許母胎界面處的組織重塑和血管生成，然后轉(zhuǎn)變?yōu)樵试S胎兒生長和發(fā)育的免疫耐受性狀態(tài)[9]。盡管對生殖過程的理解有所進(jìn)步，但著床失敗的機制在不孕癥和流產(chǎn)中仍不清楚。丹參酮是從丹參中提取的活性物質(zhì)制劑，其中，丹參酮ⅡA是其主要的病理活性成分，可抑制樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫來減弱免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)展，激活Nrf2/ARE信號通路和抑制核因子-κB(NF-κB)信號通路，具有抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等多種生物活性[10-11]。目前已有大量臨床證據(jù)表明丹參酮可以安全有效地治療包括與炎癥相關(guān)的多種疾病[12-13]。本研究中，我們進(jìn)一步評估丹參酮ⅡA對著床障礙模型大鼠子宮炎癥微環(huán)境和子宮內(nèi)膜容受性的影響，并對其作用機制進(jìn)行初步探討。

材料和方法

一、實驗動物

實驗選用SFP級SD未孕雌性和雄性大鼠(6～7周齡)共40只，雌雄比為3∶1，體質(zhì)量(250±20)g，由河北伊維沃生物科技有限公司提供，許可證號：SYXK(冀)2019-008。動物實驗于河北省實驗動物中心開展。大鼠在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(早7∶00～19∶00光照，19∶00～次日早7∶00黑暗)，飼養(yǎng)溫度23℃左右，相對濕度55%，通風(fēng)良好，自由飲水，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；飼養(yǎng)過程中依照3R原則給予所有動物人道主義關(guān)懷。本研究所涉及的實驗經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(NO IACUC-Hebmu-2019027)。

二、主要試劑

丹參酮ⅡA-磺酸鈉購自上海純優(yōu)生物(生產(chǎn)批號：568-72-9-10MG)；米非司酮片購自湖北葛店人福藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字H20033551)，于研缽中研碎后溶于丙二醇中配制成質(zhì)量濃度為0.68 g/ml的米非司酮懸混液。

三、研究方法

1.動物分組、造模與處理：造模方法參考以往文獻(xiàn)報道[14]。適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，觀察所有雌鼠動情周期，剔除動情周期差異大的大鼠，并在第2個動情周期于每日17∶00進(jìn)行交配，以雌雄比例3∶1合籠，次日9∶00發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天。將20只妊娠雌鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為正常對照組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量組(10 mg·kg-1·d-1)、丹參酮ⅡA高劑量組(20 mg·kg-1·d-1)，每組5只。妊娠第1天，丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組大鼠分別灌胃相應(yīng)劑量的丹參酮ⅡA，連續(xù)灌胃7 d；正常對照組和模型組在相同時間同法給予等體積生理鹽水。除正常對照組外，其余各組按5 mg/kg劑量在大鼠妊娠第4天9∶00行頸背部皮下注射米非司酮，以構(gòu)建胚胎著床障礙模型，孕鼠數(shù)和平均著床胚泡數(shù)均顯著減少表示造模成功；正常對照組在相同時間注射等體積生理鹽水。

各組大鼠均于妊娠第8天9∶00使用頸椎脫臼法處死，迅速剖腹，觀察子宮形態(tài)，子宮血流供應(yīng)狀況。將子宮內(nèi)膜植入位點組織剪切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，分別保存于4%多聚甲醛溶液中(行HE染色及免疫組化)或避光保存于2.5%戊二醛中(行掃描電鏡觀察)。

2.掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突數(shù)量：將戊二醛溶液固定后的標(biāo)本，用磷酸鹽緩沖液清洗，系列乙醇助劑脫水，放入體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸異戊酯中3 h，臨界點干燥，樣本粘貼，涂銀膠，鍍金，經(jīng)掃描電鏡(S-3500N，日立公司，日本)觀察胞飲突數(shù)量及形態(tài)。

3. 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)實驗：將大鼠子宮內(nèi)膜植入位點組織浸泡在RIPA緩沖液(R0010，北京索萊寶)(蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)中進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后在4℃下13 000 r/min離心30 min。收集上清，用BCA試劑盒(P0010S，碧云天)測定蛋白濃度。在PVDF膜(FFP28，碧云天)轉(zhuǎn)移之前，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(DYZ-22A型，北京六一儀器廠)處理蛋白。用兔抗大鼠白血病抑制因子(LIF)(1∶1 000，ab113262)，血管緊張素2(Ang-2)(1∶500，ab8452)，Toll樣受體4(TLR4)(1∶1 000，ab13867)，髓樣分化因子88 (MyD88)(1∶500，ab131071)、NF-κB p65磷酸化蛋白(p-p65)(1∶2 000，ab86299)多克隆抗體和兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(1∶1 000，ab1316)單克隆抗體一抗孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2 000，ab6721)孵育30 min。所有一抗和二抗均購于美國Abcam公司。PBS沖洗PVDF膜4次，每次5 min，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影。然后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(ImageQuant LAS 4000，GE Healthcare，美國)進(jìn)行圖像采集，檢測LIF、Ang-2、VEGF、TLR4、MyD88和p-p65蛋白的相對表達(dá)水平。

4. 免疫組化染色：將子宮內(nèi)膜植入位點組織樣本固定后制作石蠟切片，脫蠟脫水后，3% H2O2封閉和2%牛血清白蛋白分別用于去除內(nèi)源性過氧化物酶活性和避免非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點。然后將組織切片與抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)(1∶200，ab189778)或p65(1∶100，ab194726)的兔多克隆一抗在4℃下孵育過夜。洗滌切片，并在室溫下與山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000，ab205718)和山羊抗大鼠IgG(1∶2 000，ab97057)在4℃下孵育過夜。最后，組織切片用蘇木精復(fù)染、脫水、封片、晾干，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。分析圖像，并通過光密度/陽性面積評估TGF-β1及p65表達(dá)水平。結(jié)果判定：以棕黃色顆粒為免疫組化陽性產(chǎn)物，采用Image-Pro 6.0圖像分析軟件測定陽性表達(dá)面積。

5. 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：取子宮內(nèi)膜植入位點組織樣本稱重，4℃下研磨成5%組織勻漿，冰上靜置后3 500 r/min離心15 min，吸取上清液，ELISA法檢測炎癥相關(guān)因子脂氧素A4(LXA4)(F01000，上海西唐生物科技有限公司)、白介素(IL)-1α(ab113350，abcam，美國)、IL-1β(ab100768，abcam，美國)、IL-6(ab100713，abcam，美國)、IL-4(ab100771，abcam，美國)的水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明書操作，分別設(shè)置空白孔和樣品孔。在450 nm處測量各孔的光密度(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定LXA4、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4的濃度。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)的影響

為了研究丹參酮ⅡA對著床障礙模型大鼠著床窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響，我們首先在掃描電鏡下觀察胞飲突在子宮內(nèi)膜的表達(dá)。結(jié)果顯示，正常對照組子宮內(nèi)膜表面分布有許多膜狀突起，即發(fā)育中的胞飲突，其大小和形狀相似，膜狀突起之間的邊界清晰；模型組中子宮內(nèi)膜表面偶見較少數(shù)量的胞飲突，胞飲突發(fā)育受到抑制或降解，膜狀突起邊界不清晰；丹參酮ⅡA低劑量組僅有少量發(fā)育中或發(fā)育完全的胞飲突，部分胞飲突表面形態(tài)規(guī)則，邊界清晰，發(fā)育較對照組延后；丹參酮ⅡA高劑量組中呈現(xiàn)較多發(fā)育中或發(fā)育完全且形態(tài)規(guī)則、邊界清晰的胞飲突，發(fā)育相比對照組略延后(圖1)。

正常對照組的子宮內(nèi)膜表面分布有許多膜狀突起，即發(fā)育中的胞飲突；模型組子宮內(nèi)膜表面偶見較少數(shù)量的胞飲突；丹參酮ⅡA低劑量組僅有少量發(fā)育中或發(fā)育完全的胞飲突；丹參酮ⅡA高劑量組呈現(xiàn)較多發(fā)育中或發(fā)育完全的胞飲突。圖1 掃描電鏡下觀察胞飲突在子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況(×2 000)

二、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜LIF、Ang-2和VEGF表達(dá)的影響

采用Western blot檢測子宮內(nèi)膜LIF、Ang-2和VEGF表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組中LIF、Ang-2和VEGF表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組LIF、Ang-2和VEGF表達(dá)均顯著增加(P<0.05)(圖2)。

A：LIF、Ang-2及VEGF蛋白表達(dá)條帶圖；B：LIF蛋白相對表達(dá)水平；C：Ang-2蛋白相對表達(dá)水平；D：VEGF蛋白相對表達(dá)水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖2 丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜組織LIF、Ang-2及VEGF表達(dá)量的影響

三、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜組織TGF-β1表達(dá)量的影響

采用免疫組化染色法檢測TGF-β1在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相較于正常對照組，模型組中TGF-β1表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中TGF-β1表達(dá)水平均顯著降低(分別為P<0.05和P<0.01)(圖3)。

A：各組大鼠子宮內(nèi)膜植入位點組織中TGF-β1免疫組化染色結(jié)果(×40)；B：各組大鼠子宮內(nèi)膜植入位點組織中TGF-β1表達(dá)水平比較。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖3 丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜植入位點組織TGF-β1表達(dá)量的影響

四、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜組織炎性介質(zhì)LXA4、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-4表達(dá)的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LXA4、IL-1α、IL-1β和IL-6水平在模型組中顯著增加(P<0.01)，而IL-4水平在模型組中顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，LXA4、IL-1α、IL-1β和IL-6水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P均<0.05)，而IL-4水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著升高(P均<0.05)(圖4)。

A：LXA4表達(dá)水平；B：IL-1α表達(dá)水平；C：IL-1β表達(dá)水平；D：IL-6表達(dá)水平；E：IL-4表達(dá)水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖4 丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜組織炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響

五、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，相較于正常對照組，TLR4、MyD88、p-p65表達(dá)水平在模型組中均顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，TLR4、MyD88、p-p65表達(dá)水平在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P<0.05)(圖5)。

六、丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜組織p65表達(dá)的影響

免疫組化檢測子宮內(nèi)膜組織p65的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，p65在模型組中表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，p65在丹參酮ⅡA低劑量組和丹參酮ⅡA高劑量組中均顯著降低(P<0.05)(圖6)。

A：p-p65、MyD88及TLR4蛋白表達(dá)條帶圖；B：TLR4蛋白表達(dá)水平；C：MyD88蛋白表達(dá)水平；D：p-p65蛋白表達(dá)水平。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖5 丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜TLR4/MyD88/NF-κB通路的影響

A：各組大鼠子宮內(nèi)膜植入位點組織中p65免疫組化染色結(jié)果(×40)；B：各組大鼠子宮內(nèi)膜植入位點組織中p65表達(dá)水平比較。與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖6 丹參酮ⅡA對子宮內(nèi)膜植入位點組織p65表達(dá)的影響

討 論

不孕不育是一個世界性問題，據(jù)估計其影響發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家多達(dá)30%的夫婦[15]。在這項研究中，我們建立了著床障礙模型大鼠，從實驗角度進(jìn)一步探究丹參酮ⅡA對大鼠著床窗期子宮炎癥微環(huán)境及子宮內(nèi)膜容受性的影響，并闡明其作用機制。在給予丹參酮ⅡA后，我們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜胞飲突數(shù)量增加，使得子宮內(nèi)膜容受性的下降得到了逆轉(zhuǎn)，且子宮內(nèi)膜容受性關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子LIF的表達(dá)顯著增加，胞飲突的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果一致。據(jù)報道，LIF作為促植入細(xì)胞因子，對胚胎正常植入至關(guān)重要[16-17]。此外，在精漿-子宮內(nèi)膜相互作用過程中，上皮細(xì)胞表達(dá)增殖、分化和蛻膜相關(guān)基因，子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌炎癥因子、生長因子、細(xì)胞因子，包括LIF、VEGF和Ang-2等[16，18-19]。血管形成為胎兒和子宮內(nèi)膜之間進(jìn)行營養(yǎng)、氣體和代謝物質(zhì)的交換創(chuàng)造了適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，這一過程受到諸多互補和復(fù)雜的信號因子的嚴(yán)格控制。其中最突出的是VEGF，早期研究表明，VEGF的表達(dá)對于增加著床率具有重要影響[20]；其他研究表明，Ang-2以時空方式在著床窗期子宮內(nèi)膜中表達(dá)，并參與血管生成和血管重塑過程[21]；此外，Ang-2還是改善子宮內(nèi)膜容受性的重要因素[21]。我們的實驗結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA增加了著床障礙模型大鼠子宮內(nèi)膜Ang-2及VEGF的表達(dá)，提示丹參酮ⅡA可以改善著床窗期子宮內(nèi)膜血管生成和血管重塑，可作為提高子宮內(nèi)膜容受性的有效方劑之一。

此外，炎性微環(huán)境是影響胚胎著床和妊娠維持的一個關(guān)鍵因素[22]；炎癥反應(yīng)會改變子宮內(nèi)膜容受性[23]。胚胎著床是一個復(fù)雜的過程，子宮的炎癥環(huán)境在著床和妊娠期間從促炎狀態(tài)變?yōu)榭寡谞顟B(tài)，胚胎植入過程中需要有強烈的炎癥反應(yīng)[24]。有報道稱，VEGF的表達(dá)受多種生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)控，如TGF-β1、IL-1α、IL-6等[25]。此外，子宮組織炎癥介質(zhì)LXA4是一種能干擾胚胎著床窗口期子宮內(nèi)膜局部炎癥微環(huán)境的抗炎介質(zhì)，可調(diào)節(jié)早期妊娠的子宮內(nèi)膜和蛻膜中的炎癥事件，多項研究認(rèn)為其參與子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的進(jìn)展[26-27]。在本研究中，胚胎著床障礙后，子宮內(nèi)膜產(chǎn)生大量LXA4，而丹參酮ⅡA則抑制了LXA4的產(chǎn)生，表明丹參酮ⅡA能減輕LXA4的抗炎作用，促進(jìn)炎性因子的釋放，使種植窗期子宮內(nèi)膜保持一定的炎性環(huán)境，有利于改善子宮內(nèi)膜容受性，這與前面的報道[24]一致。此外，子宮內(nèi)膜著床障礙后，子宮內(nèi)膜產(chǎn)生促炎因子如IL-1α、IL-1β、IL-6等[28]，同時還會抑制抗炎因子如IL-4等[29]，丹參酮ⅡA治療則逆轉(zhuǎn)了這些因子的變化，說明丹參酮ⅡA在體內(nèi)可調(diào)節(jié)子宮炎性微環(huán)境，減輕炎癥。

TLR4信號通路已被廣泛研究，可通過MyD88介導(dǎo)的NF-κB激活發(fā)揮其作用[30]。作為轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB已被證實與炎癥激活密切相關(guān)[31]；此外TLR4信號相關(guān)的炎癥激活與胚胎植入密切相關(guān)[32]。NF-κB家族有5個成員，其中p65是NF-κB家族中的重要亞型，通常狀態(tài)下，NF-κB異二聚體可與其抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合體存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)NF-κB通路被激活后，磷酸化的p65蛋白(p-p65)可被釋放后轉(zhuǎn)運入核，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，因此，p-p65可作為NF-κB通路激活的標(biāo)志。NF-κB信號通路在許多生物過程中起著關(guān)鍵作用，包括子宮內(nèi)膜相關(guān)炎癥[24]。值得注意的是，NF-κB信號通路與TGF-β1在炎性微環(huán)境形成中的表達(dá)存在相關(guān)性，促炎細(xì)胞因子IL-1β可通過激活NF-κB通路、促進(jìn)p65向核易位并結(jié)合TGF-β1啟動子誘導(dǎo)慢性炎癥疾病中TGF-β1表達(dá)[33]。我們的結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA能明顯抑制TLR4、MyD88及p-p65的表達(dá)，并抑制NF-κB亞單位p65的表達(dá)，從而抑制p65的轉(zhuǎn)錄激活域，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。表明丹參酮ⅡA可通過干擾TLR4/MyD88/NF-κB信號通路進(jìn)一步改善子宮炎性微環(huán)境進(jìn)而改善著床障礙模型大鼠著床窗期子宮內(nèi)膜容受性，但這一假設(shè)仍需要進(jìn)一步研究加以驗證。

綜上，丹參酮ⅡA可以改善子宮內(nèi)膜容受性，其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，豐富子宮內(nèi)膜胞飲突的表達(dá)，改善子宮炎性微環(huán)境，提高LIF、Ang-2、VEGF和IL-4等細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。然而，由于子宮內(nèi)膜容受性的建立過程復(fù)雜，涉及眾多細(xì)胞因子和基因共同參與，本研究僅選取部分機制進(jìn)行探索，未來仍需更深入的研究加以探討。