阿爾茨海默病患者血清miR-320aAQP4水平變化及臨床意義

岳亞敏，郭素彥，楊玉博，康孝理

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿并呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以精神行為異常、認(rèn)知障礙、社會(huì)生活功能減退等為主要臨床特征，是老年人群失能的重要原因之一[1]。目前尚無(wú)藥物能阻止AD發(fā)生或延緩其進(jìn)展，早期預(yù)防AD發(fā)生至關(guān)重要[2]。

目前研究認(rèn)為，AD病理改變的中心環(huán)節(jié)與β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)在腦內(nèi)沉積密切相關(guān)[3]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可能在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4,5]。miR-320a是一種保守的miRNA，有研究通過(guò)檢測(cè)AD患者腦脊液外泌體中miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-320a在AD患者腦脊液外泌體中表達(dá)下調(diào)[6]。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)是一種跨膜通道蛋白，參與腦實(shí)質(zhì)中水的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AQP4基因缺失可導(dǎo)致腦Aβ清除受損[8]。筆者通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-320a可與AQP4的3’-非翻譯端存在結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)miR-320a、AQP4可能共同參與AD發(fā)生，但關(guān)于血清miR-320a、AQP4 水平與AD的關(guān)系尚無(wú)研究報(bào)道，基于此本研究就通過(guò)觀察AD患者血清miR-320a、AQP4 水平變化，探討二者與Aβ沉積和認(rèn)知功能的關(guān)系及對(duì)AD的診斷價(jià)值，旨在為臨床防治AD提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2022年4月濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院收治的80例AD患者為AD組，其中男44例，女36例；年齡52～87(63.54±5.68)歲；體質(zhì)指數(shù)19.7～28.3(24.51±2.17)kg/m2；文化程度：高中及以上38例,初中及以下42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《阿爾茨海默病診療指南》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥18歲；(3)初診，入院前未接受AD相關(guān)治療；(4)患者或家屬知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并帕金森病、精神分裂癥、人格障礙等其他精神疾病；(2)顱腦外傷、腦血管疾病等腦部損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害；(3)有攻擊行為或自殺傾向；(4)有嚴(yán)重軀體疾??；(5)合并嚴(yán)重心肝腎功能損害；(6)合并免疫、造血系統(tǒng)損害；(7)近3個(gè)月內(nèi)急慢性感染；(8)臨床資料不全。另選取同期34名體檢健康者為對(duì)照組，其中男18例，女16例；年齡41～85(61.87±6.21)歲；體質(zhì)指數(shù)22.8～27.2(24.07±1.87)kg/m2；文化程度：高中及以上17例、初中及以下17例。兩組一般資料比較無(wú)差異(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 收集兩組研究對(duì)象入院時(shí)空腹靜脈血6 ml，1500 xg 離心15 min，分離血清并分置兩份置于-80 ℃冰箱保存至檢測(cè)。其中一份采用Trizol法(北京凱詩(shī)源生物科技有限公司，編號(hào)：SH-2366)提取血清總RNA，莖環(huán)法(北京百奧萊博科技有限公司，編號(hào)：GS0151-WTP)轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix試劑盒(北京百邁客生物科技有限公司，編號(hào)：RK02001)說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)合成由廣州銳博生物技術(shù)有限公司完成：miR-320a正向引物：5’-GACTGTGTGGGACTTATTGAGG-3’；反向引物：5’-TGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’；內(nèi)參U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環(huán)40次后進(jìn)行熔融曲線分析，2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-320a的相對(duì)表達(dá)量。另一份采用ELISA(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，編號(hào)：E-EL-H0543c、E-EL-H0542c、E-EL-H0490c)測(cè)定血清Aβ42、Aβ40、AQP4水平，并計(jì)算Aβ42/Aβ40比值。

1.3 認(rèn)知功能評(píng)估 兩組研究對(duì)象入院后均采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表(mini-mental state examination，MMSE)[10]評(píng)估認(rèn)知功能，共6個(gè)維度和30個(gè)條目，分值0～30分。認(rèn)知功能損害標(biāo)準(zhǔn)為：文盲患者低于17分；小學(xué)文化程度低于20分；中學(xué)文化程度低于22分；大學(xué)文化程度低于23分。

2 結(jié) 果

2.1 AD組與對(duì)照組血清Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE評(píng)分比較 AD組血清Aβ42、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE評(píng)分低于對(duì)照組，血清Aβ40水平高于對(duì)照組(P<0.05)(見表1)。

表1 AD組與對(duì)照組血清Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40、miR-320a、AQP4水平和MMSE評(píng)分比較

2.2 AD患者血清miR-320a、AQP4水平與Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40水平和MMSE評(píng)分的關(guān)系 經(jīng)https://www.targetscan.org/網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-320a與AQP4的3’-非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖1)。Pearson/Spearman相關(guān)性分析顯示，AD患者血清miR-320a、AQP4水平與Aβ42、Aβ42/Aβ40和MMSE評(píng)分呈正相關(guān)，與Aβ40水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(見表2)。

表2 AD患者血清miR-320a、AQP4水平與Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40水平和MMSE評(píng)分的關(guān)系

2.3 血清miR-320a、AQP4水平對(duì)AD的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清miR-320a、AQP4水平單獨(dú)與聯(lián)合診斷AD的AUC分別為0.802、0.819、0.913，血清miR-320a、AQP4水平聯(lián)合診斷AD的AUC大于二者單獨(dú)診斷(Z=2.431、2.416，P=0.015、0.016)(見表3、圖2)。

表3 血清miR-320a、AQP4水平單獨(dú)與聯(lián)合診斷AD的價(jià)值

圖1 miR-320a與AQP4的結(jié)合位點(diǎn)示意圖

圖2 血清miR-320a、AQP4水平單獨(dú)與聯(lián)合診斷AD的ROC曲線

3 討 論

AD是一種多因素疾病，盡管近年來(lái)石杉?jí)A甲、多奈哌齊等膽堿酯酶抑制劑單藥或聯(lián)合美金剛等谷氨酸受體拮抗劑極大的改善了AD患者癥狀，但治療獲益有限，未能有效阻止或延緩AD進(jìn)展[11]。有必要進(jìn)一步探索AD發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子機(jī)制，為防治AD提供方向。

Aβ是β淀粉樣前體蛋白水解的一種蛋白肽，其在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚集后具備強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性作用，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、Tau蛋白過(guò)度磷酸化、神經(jīng)元死亡等一系列病理過(guò)程，因此Aβ沉積被認(rèn)為是AD發(fā)生的始動(dòng)因素[3]。Aβ42、Aβ40是Aβ的C端結(jié)構(gòu)主要形式，AD患者Aβ42、Aβ42/Aβ40降低和Aβ40升高反映腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積[12]。本研究中，AD患者血清Aβ42、Aβ42/Aβ40明顯降低，Aβ40水平明顯升高，符合AD患者腦內(nèi)Aβ沉積變化。目前，以靶向Aβ、Tau蛋白單克隆抗體為代表的免疫治療成為了AD藥物研發(fā)的熱門方向，多種靶向Aβ的單克隆抗體也取得較好的研究成果，但療效持久性等問(wèn)題仍待解決[13]。近年來(lái)多組學(xué)方法研究表明，表觀遺傳改變能驅(qū)動(dòng)AD的發(fā)生[14]。miR-320a基因定位于人染色體8p21.3，能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡介導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育、重塑等行為。近年來(lái)研究顯示，miR-320a在雙向情感障礙、精神分裂癥患者腦組織和神經(jīng)元中異常表達(dá)，與腦內(nèi)病理產(chǎn)物沉積相關(guān)[15,16]。本研究結(jié)果顯示，AD組血清miR-320a水平降低，符合既往研究報(bào)道[17]。結(jié)果還顯示，AD組血清miR-320a水平與Aβ42、Aβ42/Aβ40正相關(guān)，與Aβ40水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-320a水平降低可能通過(guò)引起Aβ沉積參與AD發(fā)生，其機(jī)制可能與miR-320a能抑制磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)有關(guān)。PTEN能通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信號(hào)通路增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。在Aβ25-35誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中，miR-320a能靶向抑制PTEN，減弱Aβ25-35對(duì)AD細(xì)胞的神經(jīng)毒性[19]。

AQP4是AQP家族主要成員之一，主要分布于腦實(shí)質(zhì)和主要含水間隙交界處，維持腦內(nèi)水平衡[7]。AQP4還參與神經(jīng)炎癥、神經(jīng)興奮性、突觸可塑性和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)離子穩(wěn)態(tài)等多種病理生理過(guò)程，與認(rèn)知功能密切相關(guān)[20]。在大腦皮質(zhì)注射Aβ40誘導(dǎo)的小鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)抑制AQP4基因可導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ清除受損[8]。另一項(xiàng)5xFAD小鼠模型中，敲除小鼠AQP4基因后，小鼠腦內(nèi)Aβ沉積明顯增加[21]。這些研究提示AQP4與Aβ清除和沉積密切相關(guān)。AQP4基因多態(tài)性分析研究發(fā)現(xiàn)，AQP4基因多態(tài)性能影響大腦Aβ沉積[22]。本研究發(fā)現(xiàn)AD組血清AQP4水平降低，與Aβ42、Aβ42/Aβ40正相關(guān)，與Aβ40水平呈負(fù)相關(guān)，提示AQP4水平降低與AD患者Aβ沉積相關(guān)，符合上述研究報(bào)道結(jié)果。其機(jī)制可能為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low-density lipoprotein receptor related protein 1，LRP1)作為配體受體協(xié)助細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用，能促進(jìn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞對(duì)Aβ的攝取和降解，并協(xié)助Aβ通過(guò)血腦屏障清除[23]。研究表明，AQP4基因缺失能抑制LRP1表達(dá)，減少和抑制LRP1對(duì)Aβ的清除作用[24]。MMSE為臨床AD患者常用智力狀態(tài)和認(rèn)知功能評(píng)估方式，本研究結(jié)果顯示，AD患者M(jìn)MSE評(píng)分較對(duì)照組顯著降低，提示AD患者存在明顯的認(rèn)知功能損害。結(jié)果還顯示，AD患者血清miR-320a、AQP4水平與MMSE評(píng)分呈正相關(guān)，分析是miR-320a、AQP4均能影響腦內(nèi)Aβ清除，影響AD患者認(rèn)知功能。本研究通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-320a與AQP4的3’-非翻譯端存在結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)分析顯示AD患者血清miR-320a與AQP4水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者可能共同參與AD發(fā)生。近期李俐娟等[25]報(bào)道也顯示，miR-320a能通過(guò)上調(diào)AQP4抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。最后本研究通過(guò)繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-320a、AQP4水平均可作為AD輔助診斷指標(biāo)，且二者聯(lián)合能提升AD診斷價(jià)值。

綜上所述，AD患者血清miR-320a、AQP4水平降低，二者與AD患者Aβ沉積和認(rèn)知功能相關(guān)，可作為AD輔助診斷指標(biāo)。但本研究為單中心研究，可能影響結(jié)果準(zhǔn)確性，同時(shí)本研究?jī)H分析了血清miR-320a、AQP4水平變化，關(guān)于miR-320a、AQP4參與AD的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。