應(yīng)用EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)檢測鼻咽癌組織中的EB病毒

李燕紅，周劉勇，劉倩文，吳奕晗，周顯

東莞康華醫(yī)院 病理科，廣東 東莞 523000

0 引言

鼻咽癌是指發(fā)生在鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，其發(fā)病率居耳鼻咽喉惡性腫瘤首位[1]。既往研究表明[2]：鼻咽癌呈加劇聚集現(xiàn)象，其發(fā)病多與易感基因、病毒感染及環(huán)境因素有關(guān)，臨床多表現(xiàn)為涕中帶血、聽力下降及耳悶堵感等。既往研究表明[3]：EB病毒（EBV）感染與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而EBER是EBV基因轉(zhuǎn)錄的小分子RNA，存在于EBV感染的細(xì)胞核中。傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)用于EBV-DNA中，雖然能獲得較高的檢出率，但是診斷靈敏度較低，檢測步驟較為煩瑣。而EBERRNA探針原位雜交技術(shù)是一種新型的檢測方法，借助EBER的反義寡核苷酸，利用單鏈RNA與EBER的互補(bǔ)雜交，不僅能實(shí)現(xiàn)EBV的檢測，亦可提高診斷靈敏度[4]。因此，本研究以疑似鼻咽癌患者為對象，探討應(yīng)用EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)在鼻咽癌組織中EB病毒的檢測效果，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年6月-2021年6月鼻咽癌患者109例作為對象，男81例，女28例；年齡18～81歲，平均（49.64±7.85）歲；陽性77例，陰性32例；鼻咽癌65例，其他惡性腫瘤33例，良性病變11例。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合鼻咽癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)病理組織檢查確診；②均能完成標(biāo)本采集，且患者均可耐受；③具有完整的報(bào)告，且標(biāo)本采集前均未行放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神異常、認(rèn)知功能異?；蚱髻|(zhì)性疾病者；②其他部位惡性腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或嚴(yán)重肝腎功能異常者；③自身免疫系統(tǒng)疾病、凝血功能異常者。本研究患者及家屬均知情同意，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)研究進(jìn)行。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

所有疑似鼻咽癌患者均經(jīng)病理組織檢查確診，術(shù)中取病灶組織，將上述獲得的標(biāo)本經(jīng)10.0%中性緩沖福爾馬林溶液進(jìn)行固定，常規(guī)酒精梯度脫水后，二甲苯透明，浸蠟后完成石蠟包埋，備用。

1.3.2 檢測方法

采用EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)測定不同組織中EB病毒檢出率，EBER-RNA探針試劑為河南賽諾特公司供應(yīng)，具體操作方法如下：

（1）實(shí)行標(biāo)本預(yù)處理。取蠟塊組織，常規(guī)制備4～6μm切片，并采用粘附性載玻片進(jìn)行撈片，將其放置在62～65℃恒溫箱中烤片2～4h，二甲苯脫蠟10min×3次，去除多余液體，入無水乙醇，浸泡3min×3次，取出經(jīng)空氣干燥完成5～10min。

（2）實(shí)行酶處理。結(jié)合切片上組織大小，加入80～100μL胃酶工作液，溫箱中孵育5～20min，設(shè)定溫度為37℃；上述操作完畢后，去除胃酶工作液，并完成酒精梯度脫水（75%、95%、100%各2min）。

（3）實(shí)行雜交及沖洗。上述操作完畢后，滴加5～10μL經(jīng)地高辛標(biāo)記的EBER-RNA探針，并放置蓋玻片，橡膠水封邊，37℃雜交孵育2～4h或過夜（原位雜交儀內(nèi)或濕盒內(nèi)）；操作完成后，將切片放置在PBS緩沖液中浸泡10min，待蓋玻片自然脫落后給予PBS緩沖液沖洗2min×3次。

（4）實(shí)行DAB顯色、復(fù)染及封片。根據(jù)組織的大小，滴加30～50μL HRP標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30min，采用PBS連續(xù)完成3次沖洗，每次2min，去離子水沖洗2min后將切片放置在DAB中完成5～10min顯色；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染5～10s，分化、返藍(lán)，常規(guī)酒精梯度脫水后，二甲苯透明，封片。

1.3.3 不同病理狀態(tài)下EB病毒檢出

查閱患者病歷資料，記錄不同性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，分析不同病理狀態(tài)下EB病毒檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用[n（%）]表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（）表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中EB病毒檢出率比較

82例鼻咽癌患者均完成病灶組織收集，結(jié)果表明：鼻咽癌患者病灶組織中EB檢出率高于非鼻咽癌患者組織中（P＜0.05），且陽性EBV信號定位于細(xì)胞核中，多呈深棕色，染色相對較濃，見表1和圖1。

表1 不同組織中EB 病毒檢出率比較[n（%）]

圖1 不同組織中染色示意圖（×200）

2.2 疑似鼻咽癌患者EB病毒檢出率比較

鼻咽癌患者中EB病毒檢出率年齡、性別無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；與腫瘤發(fā)生部位、腫瘤類型具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），見表2。

表2 鼻咽癌不同病理下EB 檢出率比較

2.3 疑似鼻咽癌患者EB病毒檢出率多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明：疑似鼻咽癌患者EB病毒檢出率與腫瘤發(fā)生部位、腫瘤類型具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），見表3。

表3 疑似鼻咽癌患者EB 病毒檢出率多因素Logistic 回歸分析

3 討論

既往研究表明：EB病毒在鼻咽癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，加強(qiáng)其表達(dá)測定能實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的早期篩查與診斷[6-7]。臨床上，將鼻咽癌分為角化型、非角化型與基底細(xì)胞樣型鼻咽癌三種，但是無論何種類型鼻咽癌均與EB病毒有關(guān)[8-9]。本研究中，109例疑似鼻咽癌患者均完成病灶組織的收集，結(jié)果表明：病灶組織中EB檢出率高于癌旁組織中（P＜0.05），且陽性EBV信號定位于細(xì)胞核中，多呈深棕色，染色相對較濃，從本研究結(jié)果看出，EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)用于鼻咽癌組織中EB病毒檢出率較高，能輔助臨床診療。EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)是一種新型的檢測技術(shù)，測定時采用EBER的反義寡核苷酸，一種RNA作為探針，借助該單鏈RNA與EBER互補(bǔ)雜交，能確定患者是否感染EB病毒，且臨床診斷靈敏度較高[10-11]。本研究中，鼻咽癌患者中EB病毒檢出率與腫瘤發(fā)生部位、分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），說明EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)測定鼻咽癌患者EB病毒能反應(yīng)患者疾病嚴(yán)重程度。EBER-RNA探針是一種短片段的單鏈RNA，原位雜交時不需要經(jīng)過高溫變性處理，與探針孵育過夜即可獲得良好的雜交效果，從而避免使用雙聯(lián)DNA探針進(jìn)行雜交時復(fù)性問題，有助于提高檢測敏感性[12]。本研究中，多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明：疑似鼻咽癌患者EB病毒檢出率與腫瘤發(fā)生部位、腫瘤類型具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。從本研究結(jié)果看出，鼻咽癌組織中EB病毒檢出率受到的影響因素較多，不同因素能相互作用及影響。因此，臨床上鼻咽癌患者應(yīng)加強(qiáng)EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)測定，以提高EB病毒檢出率[13-15]。

綜上所述，EBER-RNA探針原位雜交技術(shù)用于鼻咽癌組織中EB病毒檢出率較高，能反映患者病情嚴(yán)重程度，可指導(dǎo)臨床治療。