殼聚糖對植物病原體的作用機制及其影響因素

隋振全，范金石,2，尹崇山，毛金超

（1青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2省部共建生態(tài)化工國家重點實驗室培育基地，山東 青島 266042；3山東信得科技股份有限公司，山東 諸城 262200）

0 引言

微生物引發(fā)的各種植物病害使農(nóng)作物的產(chǎn)量降低、質(zhì)量下降，進而給相關從業(yè)者造成巨大經(jīng)濟損失。在過去的很長時間里，農(nóng)作物病害的防護主要依賴于化學農(nóng)藥，但過度使用化學農(nóng)藥會危害生物的多樣性、破壞生態(tài)平衡、損害人類健康。同時，化學農(nóng)藥的連續(xù)使用會引起病菌的藥抗性不斷提高或致其發(fā)生變異，使得化學農(nóng)藥的藥效逐年下降。而為了提高病害防治效果，人們不得不加大化學農(nóng)藥的使用頻次和使用量。這種“病菌藥抗性提高”與“化學農(nóng)藥使用量增大”間的惡性循環(huán)，終將會危害環(huán)境生態(tài)和人類自身。近年來，“綠色健康、可持續(xù)發(fā)展”的理念已深入人心，開發(fā)新型綠色環(huán)境友好的植物病害防治劑已成為農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的迫切需求[1]。

殼聚糖是自然界第二大天然生物質(zhì)資源甲殼素（又稱幾丁質(zhì)）在一定條件下部分脫乙酰化制得的一種天然陽離子多糖[2]，具有獨特的性質(zhì)[3-5]，如生物相容性、生物降解性、無毒性、抗菌性等，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、紡織和食品等領域具有廣泛的應用潛力[6-7]。在農(nóng)業(yè)上，殼聚糖除表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌活性外[8]，還具有提高植物的免疫力、促進植物生長發(fā)育、提高種子發(fā)芽率、提高作物產(chǎn)量、減少植物蒸騰作用等多種效能[9-11]，因此，開發(fā)以殼聚糖為活性成分的新型植物病害防治劑以滿足“綠色健康、可持續(xù)發(fā)展”的農(nóng)業(yè)發(fā)展要求具有極大的應用前景[12]。為開發(fā)此類新型植物病害防治劑提供參考，本文著重闡述了殼聚糖對植物病原體的作用機制及其影響因素，并展望了殼聚糖作為新型植物病害防治劑的發(fā)展應用前景

1 殼聚糖對植物病原體的作用機制

殼聚糖對大部分的植物病原體（真菌、細菌和病毒）表現(xiàn)出良好的抗性，可以抑制其生長或直接殺死病原體[13]。當前，殼聚糖對植物病原體的作用機制主要包括以下幾方面。

1.1 電荷作用

殼聚糖溶于酸溶液后產(chǎn)生的-NH3+會與帶有負電荷的病原體細胞表面發(fā)生強烈的電性相吸，影響細胞膜的結(jié)構(gòu)，使細胞膜的通透性發(fā)生變化，從而引起細胞內(nèi)物質(zhì)外泄，最終導致病原體的生命活動受損[14-16]。此外，質(zhì)子化的殼聚糖氨基可以和微生物細胞壁中的二價金屬離子（如Ca2+和Mg2+）通過電荷作用結(jié)合在一起，能有效阻止毒素的產(chǎn)生、降低毒素對植物的侵害[17]。

分子量較低的殼聚糖可以穿過細胞膜進入病原體細胞的內(nèi)部[18]，與病原體細胞內(nèi)帶有負電荷的細胞質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生絮凝作用，進而影響細胞的正常代謝，抑制病原體生長或殺死病原體[19]。但是，也有觀點認為，低分子量的殼聚糖進入病原體細胞內(nèi)部，可能與病原體細胞內(nèi)部的DNA 或RNA 結(jié)合，從而起到對病原體生長抑制或殺死作用[20]。

1.2 沉積作用

殼聚糖在病原體細胞表面沉積，進而影響細胞膜的通透性，導致病原體細胞無法獲得生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，并且使細胞內(nèi)部產(chǎn)生的代謝廢物累積在細胞內(nèi)，進而抑制了病原體細胞生長發(fā)育或?qū)е虏≡w死亡[21]。

Acharya等[22]研究表明：殼聚糖溶液處理后的大腸桿菌(Escherichia coli)表面會有部分殼聚糖沉積，導致吸收營養(yǎng)物質(zhì)困難，最終導致部分大腸桿菌生長緩慢和部分大腸桿菌死亡。

1.3 螯合作用

殼聚糖分子中的氨基能夠?qū)⒐聦﹄娮犹峁┙o金屬離子形成螯合物[23]，使其對金屬離子表現(xiàn)優(yōu)異的螯合性能[24]。因此，殼聚糖可以與病原體細胞中的金屬離子及其所需營養(yǎng)物質(zhì)中的微量元素發(fā)生螯合作用[25-26]，從而抑制病原體細胞的生長發(fā)育。值得注意的是，螯合性能是通過殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中未被質(zhì)子化的氨基來發(fā)揮作用，當殼聚糖溶解于酸性溶液中時，絕大部分氨基都發(fā)生質(zhì)子化，此時，螯合作用可能不再是殼聚糖抑制或殺死病原體的主導機制。

1.4 誘導作用

植物在進化過程中，進化出一套完整的防御體系來應對病原體的脅迫，并利用各種化學物質(zhì)作為信號因子來激發(fā)防御系統(tǒng)。常見的信號因子通常稱之為植物激素，如水楊酸、茉莉酸、脫落酸、生長素、乙烯、細胞分裂素等。研究表明，殼聚糖可作為一種誘導子誘導信號因子的產(chǎn)生進而激發(fā)植物的防御系統(tǒng)，或作為一種激發(fā)子來激活植物的免疫反應[26-27]。

Marta等[28]用殼聚糖溶液澆灌處理番茄植株，對其根系分泌物進行分析發(fā)現(xiàn)多種植物防御信號因子如水楊酸、茉莉酸和脫落酸等的分泌量顯著提高；同時，與空白對照組相比，經(jīng)殼聚糖溶液處理后的番茄植株的根系分泌物對根系寄生的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的生長有著2 倍的抑制。Manjunatha 等[29]發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理過的被霜霉病病株感染的小麥內(nèi)與防御相關的酶（幾丁質(zhì)酶和過氧化物酶）的含量比未采用殼聚糖處理的被霜霉病病株感染的小麥高；溫室和田間試驗表明，殼聚糖能很好地激發(fā)小麥的防御系統(tǒng)來抵抗霜霉病，用殼聚糖處理的小麥對霜霉病的防治效果分別達到79.08%和75.80%。

2 影響殼聚糖對植物病原體作用的因素

2.1 病原體

2.1.1 病原體的類型 病原體種類繁多，其細胞結(jié)構(gòu)差別較大，殼聚糖對其發(fā)揮作用的機制不同，因而表現(xiàn)出來不同的作用效果。研究表明，殼聚糖對真菌的敏感程度要高于細菌[12]，這可能和真菌細胞壁中的主要成分為幾丁質(zhì)有關。殼聚糖來源于幾丁質(zhì)，可激發(fā)植物的免疫系統(tǒng)促進幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生發(fā)生，進而激發(fā)植物體內(nèi)的免疫反應[30]。

Varma 等[31]從貝殼中提取出殼聚糖，采用瓊脂擴散法研究濃度為200 μg/mL 的殼聚糖對七種病原體（大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷白氏菌(Klebsiella pneumoniae)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)瓊脂培養(yǎng)基的抑制效果，其抑制區(qū)直徑分別為9、7、6、7、5、6、9 mm，均表現(xiàn)出良好的抑制性能。

2.1.2 病原體的生長階段 對應病原體不同的生長發(fā)育階段，殼聚糖表現(xiàn)出不同的抑制效果。Orellano等[32]在培養(yǎng)金黃色葡萄球菌V329(S.aureus V329)的初始階段加入一定量的200μg/mL 殼聚糖溶液，通過CFU 計數(shù)確定菌落的生長情況。與空白對照試驗相比發(fā)現(xiàn)：在金黃色葡萄球菌V329 培養(yǎng)的前2 h 內(nèi)，殼聚糖幾乎沒有抑菌效果；培養(yǎng)6 h左右時，殼聚糖的抑菌效果最好；而培養(yǎng)8～12 h內(nèi)的生長抑制效果基本一致。Chen等[33]研究了殼聚糖對金黃色葡萄球菌CCRC 12657(S.aureus CCRC 12657)不同生長發(fā)育階段的抑制效果，結(jié)果表明：殼聚糖對細胞指數(shù)期晚期菌落處理10 h后細胞就全部失活，而處于穩(wěn)定期和指數(shù)期中期的金黃色葡萄球菌菌落還有大約35%左右的存活率。

2.2 殼聚糖

2.2.1 脫乙酰度 殼聚糖的脫乙酰度對殼聚糖的生物活性有著重要的影響，殼聚糖的脫乙酰度越高，殼聚糖的氨基質(zhì)子化后所帶有的正電荷越高，其抗菌活性越強[34]。例如，隨著脫乙酰度(83.9%～92.2%)的提高，殼聚糖對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的抑制效果不斷提高[35]。Byun等[36]研究發(fā)現(xiàn)脫乙酰度為81.56%的殼聚糖對金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果遠遠優(yōu)于脫乙酰度為62.71%的殼聚糖。

2.2.2 分子量 截止目前，殼聚糖的抑菌效率和其分子量大小間的關系尚未形成一致的結(jié)論，甚至從不同實驗中得出的研究結(jié)論正好相反[37-38]。這可能與病原體的種類、殼聚糖的其他性質(zhì)及殼聚糖在不同情形下表現(xiàn)出不同的抑菌機制等多種因素有關。

Lana 等[39]研究了低分子量(75554.8±0.01 g/mol)、中 分 子 量(140469.4 ± 0.01 g/mol) 和 高 分 子 量(247795.2±0.01 g/mol)的殼聚糖對熱帶念珠菌(Candida tropicalis)CEMM-03-06-068、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)CEMM-01-01-193和白色念珠菌(Candida albicans)CEMM 01-05-005 達到完全抑制所需的最低濃度，研究發(fā)現(xiàn)：不同分子量殼聚糖對白色念珠菌CEMM 01-05-005達到完全抑制所需的最低濃度為512、512、512 μg/mL，不同分子量殼聚糖對熱帶念珠菌CEMM-03-06-068達到完全抑制所需的最低濃度分別為16、64、256 μg/mL，不同分子量殼聚糖對近平滑念珠菌CEMM-01-01-193達到完全抑制所需的最低濃度分別為16、32、128 μg/mL。Zheng 等[40]研究了濃度為0.25%(g/g)，分子量分別為＜5k、48.5k、72.4k、129k、166k、305 kDa的殼聚糖溶液對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果，結(jié)果表明：隨著分子量的提高殼聚糖溶液對大腸桿菌的抑菌效果不斷下降，抑菌率分別為50%、30%、5%、0%、0%、0%；隨著分子量的提高殼聚糖溶液對金黃色葡萄的抑菌效果不斷提高，抑菌率分別為0%、0%、0%、40%、95%、99%。

2.2.3 來源 眾所周知，殼聚糖是由甲殼素脫乙?；玫降模讱に貜V泛存在于甲殼類動物、昆蟲、真菌和藻類等物質(zhì)中[41-43]，不同來源的殼聚糖有著不同的生物活性。Chien 等[44]測試了從香菇菌柄和蟹殼所提取殼聚糖的抗菌活性，結(jié)果表明兩種殼聚糖均有良好的抑菌性能，但香菇菌柄殼聚糖的抑菌率優(yōu)于蟹殼殼聚糖。Byun 等[36]也研究發(fā)現(xiàn)從螃蟹的不同部位提取出的殼聚糖面對相同的病菌，其抑菌率也有著較大的差異。Chang等[45]比較了木耳中提取的殼聚糖與市售殼聚糖的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從木耳中提取的殼聚糖對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出更強的抑菌活性。

2.3 使用條件

2.3.1 濃度 隨著殼聚糖溶液濃度的提高，溶液中游離氨基的含量也不斷提高，其抑菌效果也將隨之增大。Wang 等[46]研究發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖溶液濃度增大(0～150 μg/mL)，殼聚糖溶液對糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的生長抑制率逐漸提高，在濃度超過39μg/mL時抑制率達到100%。Chien 和Chou[47]研究了脫乙酰度為94.2%、相對分子質(zhì)量為92.1 kDa(A)和357.3 kDa(B)的殼聚糖對意大利青霉菌(Penicillium italicum)的抗菌性能，結(jié)果表明：殼聚糖濃度為0.1%時，殼聚糖A和B對霉菌的生長抑制率分別為76.2%和71.2%；當殼聚糖濃度為0.2%時，則相應增大到78.6%和90.5%。

2.3.2 pH pH 對殼聚糖的抑菌性能影響巨大，因為殼聚糖的溶解性和氨基質(zhì)子化程度都與pH 直接相關。殼聚糖只溶解于酸性介質(zhì)之中[48]，當pH＜6.5時，它的抑菌活性和氨基質(zhì)子化程度均隨著pH 的降低而不斷增強[12]；而當溶液pH 6.5～7 時，由于殼聚糖的氨基質(zhì)子化程度極低因而幾乎沒有抑菌活性。Piegat 等[49]研究了不同pH 下殼聚糖溶液對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的殺菌率，通過與空白對照試驗相比發(fā)現(xiàn)：隨著pH(pH＜6)的降低殼聚糖溶液的殺菌率逐漸提高，但當pH＜5 時，酸對病原體的殺菌效果占據(jù)主要地位。

2.3.3 溫度 溫度對殼聚糖的抗菌活性有很大影響，在4～37℃的范圍內(nèi)，殼聚糖的抑菌活性隨溫度的升高而逐漸增強。這主要是因為溫度會影響殼聚糖與細胞的反應速率和細胞表面可結(jié)合位點數(shù)目的變化所導致的，較低的溫度會改變細胞的表面結(jié)構(gòu)、減少殼聚糖的表面結(jié)合位點[50]，進而引起殼聚糖抑菌性能的下降。Ardila 等[51]研究了在37℃、20℃和7℃下殼聚糖溶液對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的抑菌效果，結(jié)果為37℃時抑菌效果最好，20℃次之，7℃最差。

2.4 其他因素

對于工業(yè)化應用而言，批量制備是必要的，然而在貨架儲藏期間，儲存溫度和時間也會對殼聚糖的抑菌功效也會產(chǎn)生影響。這是因為在儲存期間，殼聚糖的某些特性，如粘度或分子量，會發(fā)生改變，從而對其抑菌活性產(chǎn)生一定影響。Hong等[52]研究了在25℃和4℃下，分別采用乙酸溶解得到的殼聚糖溶液儲存15周后粘度和對金黃色葡萄球菌的殺菌效果的變化，結(jié)果表明：乙酸殼聚糖溶液在4℃下儲存15 周后粘度和殺菌效果下降了初始值的46%和10%，在25℃下降了81%和18%。研究表明，殼聚糖溶液的粘度和抑菌活性隨著儲存時間和溫度的增加而降低。

3 展望

基于殼聚糖優(yōu)良的抗菌特性以及天然無毒、生物相容性良好和可生物降解性等特性，開發(fā)殼聚糖基植物病害防治劑，符合農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展需求，能夠替代相關化學農(nóng)藥的使用，尤其是應用在高品質(zhì)、高經(jīng)濟效益農(nóng)作物的種植上更能彰顯出其特色優(yōu)勢。

當前殼聚糖對植物病原體的作用研究還不夠全面系統(tǒng)，其抑菌機理多數(shù)以推測和假設為主，不同的研究方法所得出的研究結(jié)果間也存在差異。因此，為更好地開發(fā)以殼聚糖為活性成分的植物病害防治劑，還應加強以下幾方面的研究：（1）利用先進的儀器設備（如冷凍電鏡和掃描透射電子顯微鏡）考察殼聚糖和植物病原體之間的作用方式，進一步剖析殼聚糖的抑菌機制；（2）通過建立三維生物細胞模型分析殼聚糖對植物病原體的作用機制，并與實驗結(jié)果印證；（3）逐步建立起完整的殼聚糖對病原體作用的數(shù)據(jù)庫，以避免殼聚糖的自身因素（如分子量、脫乙酰度和來源）和病原體種類所引起的研究結(jié)果間的差異；（4）建立統(tǒng)一的或分類標準，以克服不同研究方法所得結(jié)論間存在差異甚至出現(xiàn)截然相反結(jié)論的現(xiàn)象發(fā)生。