G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1的理化性質(zhì)及其分子結(jié)構(gòu)的分析

王 道, 陳建林

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科, 長沙 410011）

雌激素（estrogen）屬于類固醇激素, 在細(xì)胞生理及病理過程中具有廣泛而重要的調(diào)節(jié)作用。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1（G protein-coupled estrogen receptor1, GPER1）, 又名GPR30, 是一種功能性雌激素受體, 主要參與調(diào)節(jié)雌激素活化的快速非基因信號通路[1-2]。2002年, Filardo等[3]報(bào)道了該受體對雌激素有高度的親和力, 定位于質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中, 其在不同類型的組織中表達(dá), 包括腦、肺、肝、脂肪組織、血管及免疫細(xì)胞等。然而, GPER1的發(fā)現(xiàn)使得研究雌激素受體蛋白在許多疾病中的作用變得更加復(fù)雜, 因?yàn)镚PER1的表達(dá)可能取決于物種、組織、年齡和性別[4]。既往研究表明, 敲除GPER1可以抑制PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）, 從而阻礙胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。另有研究證實(shí), GPER1還能觸發(fā)不同的級聯(lián)反應(yīng), 特別是在乳腺癌細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)刺激作用[6], GPER1能夠分別觸發(fā)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）和乳腺腫瘤細(xì)胞中的重組人白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）以及白介素受體1（interleukin-1 receptor 1, IL1R1）的表達(dá)[7]。大量研究數(shù)據(jù)也都表明, GPER1在大多數(shù)惡性腫瘤疾病中表達(dá), 如黑色素瘤[8]、胰腺癌[9]、前列腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]和肝細(xì)胞癌[12]等, 因此, GPER1可能成為治療癌癥的靶點(diǎn)。此外, GPER1在小鼠模型中被證實(shí)可調(diào)節(jié)體重和葡萄糖/脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài), 發(fā)揮抗肥胖和抗糖尿病作用, 使其還可能成為治療肥胖和糖尿病的有效藥物[13]。最新研究報(bào)道, GPER1與多發(fā)性硬化癥、帕金森氏病、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥有關(guān)[14], 但確切的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

本研究借助多種生物信息學(xué)在線工具對GPER1蛋白的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、腫瘤相關(guān)性等方面進(jìn)行綜合分析, 以期闡明GPER1結(jié)構(gòu)特性及其在腫瘤中的內(nèi)在機(jī)制, 為探究其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機(jī)制提供理論依據(jù), 為癌癥等疾病的治療提供候選靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

通過美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（national center for biotechnology information, NCBI）[15], 搜尋基因數(shù)據(jù)庫并且下載得到人類GPER1的氨基酸序列信息, GenBank登錄號為NP_001091671。

1.2 方法

獲得人類GPER1蛋白的FASTA格式的氨基酸序列, 通過多種軟件和網(wǎng)站預(yù)測和分析GPER1理化性質(zhì)、信號肽結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾位點(diǎn)、相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)以及與腫瘤的相關(guān)分析（表1）。

表 1 預(yù)測分析人GPER1的生物信息數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站Tab. 1 Bioinformatic databases and websites for predictive analysis of human GPER1

2 結(jié)果與分析

2.1 GPER1的理化性質(zhì)分析

進(jìn)入ExPasy網(wǎng)站[16], 利用Protparam在線對人類GPER1的理化性質(zhì)分析, 結(jié)果表明：該蛋白的相對分子質(zhì)量為42 247.59 Da；理論等電點(diǎn)為8.63, 分子式為C1938H3018N510O509S20, 分別含有30個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基（Arg + Lys）和25個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）；總原子數(shù)為5 995；消光系數(shù)為39 015, 半衰期為30 h, 不穩(wěn)定系數(shù)為48.12, 屬于不穩(wěn)定蛋白, 脂肪系數(shù)為110.51, 親水性平均值為0.449, 表明該蛋白是疏水性蛋白。組成GPER1的氨基酸共有20種, 其中含量最高的是異亮氨酸, 占13.60%；含量最少的是色氨酸, 只有1.07%（表2）。

表2 GPER1的氨基酸組成Tab. 2 Amino acid composition of GPER1

ProtScale在線分析GPER1的親疏水性, 結(jié)果表明：最強(qiáng)的親水位點(diǎn)在第250位的亮氨酸, 親水值為 2.656；最強(qiáng)的疏水氨基酸是265位的纈氨酸, 親水性分值為3.567。ProtScale分析的367個(gè)氨基酸（第5～371位）中有39.23%分布在低分值區(qū)域, 總得分為 121.137；60.49%分布在score大于0區(qū)域, 總得分為285.134。這表明親水氨基酸少于疏水氨基酸, GPER1存在大量疏水域, 人類GPER1屬于疏水性蛋白（圖1）。

2.2 GPER1信號肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)分析

登錄SignalP 5.0 Server網(wǎng)站[17], 分析人類GPER1信號肽序列, 結(jié)果顯示, 存在信號肽的概率為0.003%, 而且沒有發(fā)現(xiàn)切割位點(diǎn), 推測不存在信號肽序列（圖2）。

進(jìn)入TMHMM 2.0網(wǎng)站[18], 分析人GPER1跨膜結(jié)構(gòu), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域, 分別位于第63～85位、第97～119位、第134～153位、第174～196位、第219～241位、第262～284位、第304～326位氨基酸殘基之間（圖3）。

2.3 GPER1亞細(xì)胞定位分析

PSORTII在線網(wǎng)站[18]對人類GPER1進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析, 結(jié)果顯示, 人類GPER1定位于不同細(xì)胞器的可能性分別是：細(xì)胞質(zhì)膜（60.90%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（13.00%）、液泡（17.40%）、線粒體（4.30%）和高爾基體（4.30%）（表 3）。

表3 人GPER1蛋白的亞細(xì)胞定位可能性Tab. 3 Subcellular localization probability of human GPER1 unit: %

2.4 GPER1的二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析

PSIPRED在線網(wǎng)站[19]預(yù)測人類GPER1蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu), 結(jié)果顯示, 多肽鏈中α-螺旋占68.53%, 無規(guī)則卷曲占29.87%, β-折疊鏈占1.60%（圖4）。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示, GPER1屬于7TM_GPCRs 超家族, 該結(jié)構(gòu)域由276個(gè)氨基酸殘基組成（圖5）。

2.5 GPER1翻譯后修飾位點(diǎn)分析

進(jìn)入ExPasy網(wǎng)站[16], 利用NetNglyc-1.0、NetOGlyc-4.0、NetPhos3.1在線分別對人GPER1N-糖基化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：人類GPER1存在4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn), 分別位于第25、32、44和84位的氨基酸（圖6）；10個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn), 分別位于第4、5、18、26、27、28、34、40、46和287位的氨基酸；27個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn), 其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)17個(gè), 蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)7個(gè), 酪氨酸磷酸化位點(diǎn)3個(gè)（圖7）。

2.6 GPER1蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)分析

進(jìn)入STRING12.0數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站[20], 預(yù)測與GPER1發(fā)生相互作用的蛋白, 構(gòu)建了與GPER1蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（圖8）。與GPER1發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)評分前10名的有雌激素受體1（estrogen receptor 1, ESR1）、Discs大同源物4（discs large homolog 4, DLG4）、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白Q（guanosine nucleotide-binding protein Q, GNAQ）、G蛋白α亞基（G protein alpha-subunit, GNAS）、雌激素受體2（estrogen receptor 2, ESR2）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase, SRC）、G蛋白偶聯(lián)受體62（G protein-coupled receptor 62, GPR62）、G蛋白偶聯(lián)受體61（G protein-coupled receptor 61, GPR61）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、酪氨酸蛋白激酶2（protein tyrosine kinase 2, PTK2）, 相關(guān)評分分別是0.985、0.957、0.935、0.925、0.921、0.915、0.909、0.908、0.839、0.814。

2.7 GPER1與腫瘤的相關(guān)性分析

GPEIA數(shù)據(jù)庫[21]顯示出人GPER1在不同類型腫瘤組織中的表達(dá)水平, 結(jié)果表明, 人GPER1在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma, ACC）、膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, BLCA）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma, BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma, CESC）、結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma, COAD）、腎嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe renal cell carcinoma, KICH）、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）、 直腸腺癌（rectum adenocarcinoma, READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC）組織中低表達(dá)（P＜0.05）（圖 9）。

圖 8 與人GPER1相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig. 8 Protein network interacted with human GPER1

采用人類蛋白質(zhì)圖譜（the human protein atlas, HPA）數(shù)據(jù)庫中GPER1在UCEC腫瘤組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的免疫組化的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示, GPER1在子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞中染色強(qiáng)度為弱, 數(shù)量小于25%（圖10a）, 在正常組織中染色強(qiáng)度中等, 數(shù)量為75%（圖10b）。由此可知, GPER1在UCEC中的表達(dá)量低于其在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá), 而且在UCEC中的陽性表達(dá)全部集中在細(xì)胞質(zhì)和膜質(zhì)上。

分析人GPER1的表達(dá)水平與UCEC患者的生存期的關(guān)系, 從“TCGA”來源的GPEIA數(shù)據(jù)庫獲取GPER1高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的總體生存期（overall survival, OS）曲線和無病生存期（disease free survival, DFS）曲線。結(jié)果表明：在UCEC中GPER1低表達(dá)患者的總生存率分析中, 其LogrankP=0.170, 差異不顯著；在UCEC中GPER1低表達(dá)患者的無病生存期低于其高表達(dá)患者, 其LogrankP=0.042, 差異顯著（圖 11）。

利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析GPER1突變信息和其對UCEC預(yù)后的影響, 結(jié)果表明, TCGA數(shù)據(jù)庫1 450例子宮內(nèi)膜癌患者樣本中, 其中17例發(fā)生GPER1擴(kuò)增, 4例深度刪除, 2例截短突變, 14例錯(cuò)義突變, 共37例患者的GPER1發(fā)生突變, 基因突變率為2.6%（圖12a）。同時(shí),GPER1基因突變對UCEC患者的OS有明顯的影響, 能顯著降低患者總生存率, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）, 但對UCEC患者的DFS沒有顯著影響（P＞0.05）（圖12b）。

3 討論

GPER1基因位于人類染色體7p22.3上, 與其他GPCRs相似, GPER1的N端區(qū)位于細(xì)胞外, 而C末端區(qū)在細(xì)胞內(nèi)[22]。本研究結(jié)果顯示, GPER1屬于不穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì), 由20種氨基酸組成, 無信號肽, 含有7次跨膜結(jié)構(gòu)域, 亞細(xì)胞主要位于細(xì)胞質(zhì)膜上, 提示該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)揮重要功能, 有利于胞外信號分子傳遞到胞內(nèi)產(chǎn)生信號反應(yīng), 這個(gè)結(jié)果與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析是一致的, 正電荷氨基酸殘基數(shù)目多于負(fù)電荷氨基酸殘基, 表明該蛋白傾向結(jié)合某些帶負(fù)電荷基團(tuán)。GPER1的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主, 無規(guī)則卷曲散布在結(jié)構(gòu)內(nèi), 使其空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣, 這與Khan等[23]研究報(bào)道相一致。GPER1的結(jié)構(gòu)多樣性并具有多種生理功能, 結(jié)構(gòu)域分析它屬于GPCRs超家族, 7TM保守結(jié)構(gòu)域位于60～335位氨基酸。GPCRs是人體內(nèi)最大的膜受體蛋白家族, 在生殖、神經(jīng)、心血管、免疫和內(nèi)分泌等系統(tǒng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[24], 使其可能成為治療藥物的主要靶點(diǎn)。

磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測表明, 除結(jié)構(gòu)域以外的其他氨基酸可能對GPER1起修飾激活的作用。哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞的生長和存活, 以及腫瘤細(xì)胞的遺傳、代謝、炎性和微環(huán)境機(jī)制改變都與糖基化修飾改變密切相關(guān)[25]。有文獻(xiàn)報(bào)道, GPER1 N-端的結(jié)構(gòu)域中的Asn44是受體結(jié)構(gòu)和活性所必需, 但是Asn25和Asn32不會發(fā)揮任何主要作用[26]。本文糖基化修飾結(jié)果表明：GPER1存在4個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 分別位于第25、32、44和84位的氨基酸；10個(gè)O-糖基化位點(diǎn), 分別位于第4、5、18、26、27、28、34、40、46和287位的氨基酸。Pupo等[27]研究表明, 缺失糖化的GPER可能會誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞遷移, 因此, 特異性干擾GPER糖蛋白可作為一種新的治療策略。異常磷酸化途徑也會與許多疾病發(fā)展有關(guān)[28]。本文結(jié)果顯示, GPER1存在27個(gè)磷酸化位點(diǎn), 其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)17個(gè), 蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)7個(gè), 酪氨酸磷酸化位點(diǎn)3個(gè), 這些磷酸化位點(diǎn)的功能尚未知曉, 有待進(jìn)一步研究。

通過STRING可知, 與GPER1發(fā)生相互作用的TOP10蛋白, 包括ESR1、DLG4、GNAQ、GNAS、ESR2、SRC、GPR62、GPR61、EGFR、PTK2。有文獻(xiàn)報(bào)道, 在體外過表達(dá)ESR1能夠抑制JAK/STAT3信號通路, 阻礙細(xì)胞增殖、遷移[29]；前列腺癌中DLG4的表達(dá)水平與正常組織存在顯著差異[30]；GNAQ被抑制可誘導(dǎo)EMT過程, 促進(jìn)腫瘤侵襲性[31]；GNAS可以促進(jìn)小鼠炎癥性肝細(xì)胞癌的發(fā)展, 并與較差的存活率相關(guān)[32]；ESR2和SRC表達(dá)模式與卵巢腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)[33]；GPR62和GPR61能激活雄性生殖細(xì)胞cAMP途徑[34]；EGFR發(fā)生二聚化和磷酸化, 其激活機(jī)制與肺腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[35]；在乳腺癌細(xì)胞的侵襲性研究中, FAK（又名PTK2）有助于GPER1介導(dǎo)STAT3激活, 促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖[36]。GPER1與以上腫瘤相關(guān)的蛋白相互作用, 能夠影響不同類型腫瘤細(xì)胞, 提示該蛋白與腫瘤發(fā)生有密切聯(lián)系。

隨后, 本研究進(jìn)一步查詢GPEIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)：人類GPER1在ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD、KICH、LUAD、LUSC、READ、STAD、UCEC組織中的表達(dá)水平均低于癌旁正常組織, 可見GPER1的表達(dá)在上述腫瘤組織中被抑制。Zhang等[37]研究發(fā)現(xiàn), 低水平的GPER1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn), 相比低表達(dá)的UCEC患者, GPER1高表達(dá)的患者無病生存率升高, 由此推測, 人類GPER1可作為UCEC病情評估的生物標(biāo)志物。這與Deng等[38]認(rèn)為GPER1在UCEC中起關(guān)鍵作用, 可作為預(yù)后觀察指標(biāo)的觀點(diǎn)相一致?；蛲蛔円才c腫瘤形成和進(jìn)展密切相關(guān)[39], 本研究中GPER1在UCEC患者中存在基因突變, 并且突變組UCEC患者總生存率明顯下降。

綜上所述, 本研究對人GPER1理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行探討, 提示該蛋白是癌癥臨床病理和預(yù)后相關(guān)的重要因子。但是, 由于數(shù)據(jù)庫的局限性可能會對數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定的選擇偏倚, 人類GPER1自身還存在復(fù)雜的分子機(jī)制, 后續(xù)還需深入的臨床和試驗(yàn)來驗(yàn)證其在腫瘤疾病中的重要價(jià)值。