免疫熒光技術(shù)在魚類生殖細(xì)胞發(fā)育研究中的應(yīng)用

楊聰慧, 楊福忠, 朱 辣, 羅心玥, 趙如榕, 張 純*

（1. 省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長沙 410081； 2. 湖南湘云生物科技有限公司, 常德 415101）

生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的功能分子標(biāo)記在研究試驗(yàn)對象的生殖和育性機(jī)理中發(fā)揮著重要作用, 已被廣泛應(yīng)用于人類及其他模式生物的生殖細(xì)胞發(fā)育研究中[1-2], 但在魚類中應(yīng)用較少。本研究使用的功能分子標(biāo)記為RNA Pol II CTD（S5）蛋白, 即RNA聚合酶II中最大亞基RPB1的羧基末端結(jié)構(gòu)域（carboxy terminal domain of RNA polymerase II, RNA Pol II CTD）的第5位絲氨酸磷酸化（phosphorylation of serine-5, S5）蛋白。RNA Pol II CTD是RNA聚合酶II具有活性的必需結(jié)構(gòu)和進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動(dòng)的主要參與元件, 其作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)酶復(fù)合物的協(xié)同轉(zhuǎn)錄、調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)以及新生RNA的加工[3-4]。RNA Pol II CTD是一條高度保守的重復(fù)序列, 由7個(gè)氨基酸殘基（酪氨酸1-絲氨酸2-脯氨酸3-蘇氨酸4-絲氨酸5-脯氨酸6-絲氨酸7）作為重復(fù)單位元件, 重復(fù)次數(shù)為26～52次。該結(jié)構(gòu)的七肽會(huì)發(fā)生磷酸化和去磷酸化的循環(huán)反應(yīng), 從而影響RNA聚合酶Ⅱ?qū)RNA的5'帽子和3'末端的加工及基因外顯子的識(shí)別剪切過程[5]。其中, RNA Pol II CTD（S5）的磷酸化修飾主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始階段[6], 這使其可作為轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)記因子來顯示生物是否進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)錄及基因轉(zhuǎn)錄的活躍狀態(tài)。所以, 采用RNA Pol II CTD（S5）蛋白作為魚類生殖細(xì)胞發(fā)育的功能分子標(biāo)記, 對不同發(fā)育狀態(tài)魚類生殖細(xì)胞的染色體進(jìn)行免疫熒光分析, 可發(fā)展為定位和檢測與生殖細(xì)胞分裂過程的調(diào)控及發(fā)育密切相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域及其細(xì)胞相特征的一個(gè)有效途徑。

免疫熒光原位雜交技術(shù)（immunofluorescencein situhybridization technique, Immuno-FISH）, 簡稱免疫FISH, 是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理, 將特異性抗原或抗體定位于試驗(yàn)細(xì)胞或細(xì)胞中的染色體上的一種常用標(biāo)記技術(shù), 用以對特異蛋白抗原或抗體在細(xì)胞或染色體上的分布、表達(dá)量等情況進(jìn)行研究, 以達(dá)到定量、定位檢測的效果。該技術(shù)已在人、小鼠、斑馬魚、果蠅等模式生物的染色體免疫熒光定位分析中有較多報(bào)道[7-11]。在魚類中, 常使用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescencein situhybridization, FISH）對特異性遺傳序列進(jìn)行染色體定位, 利用5S rDNA（染色體臂間標(biāo)記因子）、著絲粒DNA（著絲粒標(biāo)記因子）等串聯(lián)重復(fù)序列作為探針進(jìn)行多倍體鑒定、雜交檢測或染色體結(jié)構(gòu)畸變等研究[12-13]。目前, 利用基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控相關(guān)的功能分子標(biāo)記進(jìn)行魚類生殖細(xì)胞染色體免疫熒光分析的研究很少。因此, 本研究選用了常規(guī)淡水試驗(yàn)魚鯉（Cyprinus carpio, 俗稱common carp）作為研究對象, 對其生殖細(xì)胞的染色體進(jìn)行RNA Pol II CTD（S5）蛋白定位分析, 以探討魚類生殖細(xì)胞染色體免疫熒光的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所取用的試驗(yàn)魚鯉來自于湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及湖南湘云生物科技有限公司, 性腺組織等需解剖后取材, 試驗(yàn)魚在被解剖前都使用2-苯氧乙醇（美國西格瑪）實(shí)施昏迷處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 染色體制片

試驗(yàn)魚剪鰓放血5～10 min后進(jìn)行解剖, 取性腺用以制備生殖細(xì)胞染色體, 取腎臟用以制備體細(xì)胞染色體。用腎臟進(jìn)行染色體制片時(shí), 需要在取材之前根據(jù)魚的體重注射適量植物血球凝集素（phytohemagglutinin, PHA）溶液, 以刺激腎組織中的淋巴細(xì)胞分裂, 并根據(jù)魚的體重注射適量秋水仙素溶液, 以阻止細(xì)胞完成細(xì)胞分裂。將取好的材料放在培養(yǎng)皿中, 添加適量生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%）以維持材料的細(xì)胞形態(tài)。用小剪刀剪碎相關(guān)材料, 移置15 mL離心管中吹打7～9 min。靜置6～9 min后, 緩慢吸取上清液, 注意不要吸取沉淀, 離心（1 200 r/min, 5 min）, 棄上清液, 留沉淀。在離心得到的細(xì)胞沉淀中加入0.050% KCl低滲液（腎臟細(xì)胞用0.075% KCl低滲液）, 低滲60～120 min, 離心（1 200 r/min, 5 min）, 棄上清液, 留沉淀。加入適量卡諾氏液（注意卡諾氏液需要現(xiàn)配現(xiàn)用, 甲醇和乙酸3∶1體積比的混合液）, 反復(fù)固定細(xì)胞沉淀2～5次, 每次固定15 min, 離心（1 200 r/min, 5 min）, 棄上清液, 留沉淀。固定好后, 加入少許卡諾氏液, 吹散細(xì)胞沉淀。滴片時(shí), 將細(xì)胞懸液滴于載玻片正中央。細(xì)胞懸液于4℃或-20℃冰箱保存。

1.2.2 免疫熒光定位

在低溫下, 加入適量5%多聚甲醛, 固定相關(guān)細(xì)胞及染色體制片10 min, 使用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）重復(fù)清洗3次, 每次2 min。然后將染色體制片置于2.0% Triton X-100溶液中5 min, 使用1×PBS重復(fù)清洗3次, 每次2 min。將染色體制片置于5%牛血清白蛋白溶液中, 封閉20 min。加入適量一抗RNA Pol II CTD（S5）（1∶100 dilution；Abcam5131）稀釋液, 將染色體制片放在濕盒中, 4℃下孵育12 h, 然后使用1×PBS重復(fù)清洗。在避光條件下, 加入適量異硫氰酸熒光素（fluorescein Isothiocyanate, FITC）標(biāo)記的二抗稀釋液, 在37℃下孵育60 min, 使用1×PBS重復(fù)清洗幾次。滴加少量4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL）染液, 采用熒光數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)（DM4B, 徠卡Leica, 德國）觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片的影響

在免疫熒光試驗(yàn)過程中, 染色體標(biāo)本的儲(chǔ)存方式、儲(chǔ)存條件、儲(chǔ)存時(shí)間及滴片時(shí)的處理方式對試驗(yàn)效果有著非常重要的影響。在其他試驗(yàn)條件保持相對穩(wěn)定的前提下, 本研究設(shè)置儲(chǔ)存時(shí)間梯度并對不同儲(chǔ)存方式（制備好的細(xì)胞懸液或染色體制片）進(jìn)行了對比試驗(yàn)。結(jié)果表明（表1）, 以細(xì)胞懸液的方式于-20℃儲(chǔ)存的染色體標(biāo)本做出的免疫熒光試驗(yàn)效果比較好, 即滴片需現(xiàn)滴現(xiàn)用, 不能以滴在玻片上的形式儲(chǔ)存。當(dāng)然, 若儲(chǔ)存時(shí)間較久, 染色體形態(tài)也會(huì)發(fā)生改變, 從而影響試驗(yàn)結(jié)果。因此, 在儲(chǔ)存過程中需勤換存儲(chǔ)液, 以保護(hù)染色體的形態(tài)及其固有的蛋白活性。此外, 在試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn), 由于蛋白質(zhì)加熱后易失活, 在冰凍玻片上滴片后, 不能用酒精燈烤片, 應(yīng)靜置于常溫, 讓其自然風(fēng)干。

表1 片齡以及儲(chǔ)存環(huán)境的不同對鏡檢效果統(tǒng)計(jì)Tab. 1 Microscopy results statistics of specimens preserved in different methods and duration

2.2 洗片方式的影響

由于用以免疫熒光試驗(yàn)的染色體制片沒有經(jīng)過烘烤, 導(dǎo)致染色體在玻片上的黏附程度以及形態(tài)的穩(wěn)定性會(huì)有所下降。而且, 在后續(xù)的試驗(yàn)過程中, 完成每一步反應(yīng)后都需要對染色體制片進(jìn)行清洗, 清洗的程度對后續(xù)的反應(yīng)以及最終試驗(yàn)結(jié)果中細(xì)胞的形態(tài)有著重要的影響。最終鏡檢結(jié)果中變形的細(xì)胞如圖1所示。在其他試驗(yàn)條件保持相對穩(wěn)定的前提下, 本研究對洗片過程中不同搖晃程度、搖晃時(shí)間及洗片溶液等因素進(jìn)行了對比試驗(yàn)。

圖1 免疫熒光定位檢測中變形的細(xì)胞（比例尺為15 μm）Fig. 1 The distorted cells in immunofluorescence experiment (Scale bar is 15 μm)

為了更直接地觀察洗片方式對細(xì)胞形態(tài)的影響, 在染色體制片完成后直接對玻片進(jìn)行清洗, 再用吉姆薩染液進(jìn)行染色觀察, 最后選擇幾種具有代表性的洗片方式進(jìn)行完整的免疫熒光試驗(yàn)。試驗(yàn)全程均使用黏附正電荷防脫玻片。

結(jié)果表明（表2）, 在洗片過程中搖晃時(shí)間越長, 最終試驗(yàn)結(jié)果中的細(xì)胞變形越厲害, 但完全不搖晃又可能會(huì)導(dǎo)致熒光鏡檢時(shí)的背景有些許不干凈。因此, 可以選擇每間隔2 min輕輕搖晃, 以保證洗干凈殘留的試劑。染色體制片在預(yù)試驗(yàn)吉姆薩染液染色觀察后, 需要用流水沖洗?？紤]到流水沖洗的影響, 本研究做了一個(gè)不洗片直接染色后沖洗的染色體制片。結(jié)果表明, 在玻片背面用流水沖洗并不會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)。因此, 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)也可以采用沖洗的方法來清洗免疫熒光試驗(yàn)過程中殘留在玻片上的試劑。

表2 洗片方式對鏡檢結(jié)果的影響Tab. 2 Microscopy results statistics of specimens treated in different washing methods

2.3 RNA Pol II CTD（S5）蛋白免疫FISH在鯉生殖細(xì)胞的定位特征

以鯉體細(xì)胞作為對照, 利用免疫熒光技術(shù)對RNA Pol II CTD（S5）蛋白在鯉生殖細(xì)胞染色體中進(jìn)行定位分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2）, 在鯉的生殖細(xì)胞分裂相中可檢測到規(guī)律性的特異性定位信號(hào)。對免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn), 鯉體細(xì)胞染色體的RNA Pol II CTD（S5）定位信號(hào)數(shù)目明顯比生殖細(xì)胞的多, 且在數(shù)目上呈現(xiàn)一定的規(guī)律性（表3）：體細(xì)胞間期分裂相主要呈現(xiàn)21～24個(gè)信號(hào), 也有一部分為8～12個(gè)信號(hào)；中期分裂相主要呈現(xiàn)10～12個(gè)信號(hào), 也有一部分為1～5個(gè)信號(hào)。在鯉生殖細(xì)胞中（表4）, 處于減數(shù)第一次分裂前期的生殖細(xì)胞主要呈現(xiàn)8～20個(gè)信號(hào), 數(shù)目明顯多于處于其他減數(shù)分裂階段的生殖細(xì)胞的信號(hào)數(shù)。隨著減數(shù)分裂的進(jìn)行, 生殖細(xì)胞中的特異性信號(hào)逐漸減少, 在成熟精子中則檢測不到相關(guān)信號(hào)。該結(jié)果表明, 鯉雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄活性具有一定的規(guī)律性。

表3 鯉體細(xì)胞中信號(hào)數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab. 3 Statistics of signals number in somatic cells of common carp

表4 鯉生殖細(xì)胞中信號(hào)數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab. 4 Statistics of signals number in germ cells of common carp

圖2 RNA Pol II CTD（S5）蛋白在鯉體細(xì)胞和生殖細(xì)胞染色體中的免疫熒光檢測Fig. 2 Immunofluorescence detection of RNA Pol II CTD (S5) protein in chromosomes of common carp somatic and germ cells

3 討論

生殖生物學(xué)一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一, 而魚類的生殖發(fā)育研究在基礎(chǔ)理論及育種實(shí)踐方面都具有非常重要的意義。在生殖細(xì)胞發(fā)育的研究中, 有效的功能分子標(biāo)記有助于研究試驗(yàn)對象的生殖發(fā)育及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)理, 在哺乳動(dòng)物和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。例如, 我國學(xué)者已經(jīng)從單細(xì)胞水平系統(tǒng)闡述了人類精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變路徑, 挖掘出多個(gè)只在特定細(xì)胞類型表達(dá)的關(guān)鍵功能分子標(biāo)記[14]。在魚類中, 得以鑒定的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因也日益增多, 包括vasa、nanos、dnd（dead-end）、dazl（deleted in azoospermialike）、sdf1（stromal cell-derived factor-1）和cxcr（chemokine receptor）等[15-19]。但這些基因的表達(dá)多集中在原生殖細(xì)胞（primordial germ cells, PGCs）, 而魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育過程（以雄性生殖細(xì)胞為例）涉及PGCs、精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子等多種細(xì)胞類型。因此, 僅使用上述幾個(gè)分子標(biāo)記來探索魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育機(jī)理還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠, 亟需挖掘新的功能分子標(biāo)記并應(yīng)用于魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育過程研究中。本研究利用RNA Pol II CTD（S5）蛋白作為分子標(biāo)記對鯉雄性生殖細(xì)胞核進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn), 成功獲得了定位信號(hào), 并對染色體標(biāo)本保存條件、洗片方式等技術(shù)參數(shù)進(jìn)行探討和總結(jié)。該研究結(jié)果不僅為魚類生殖發(fā)育過程中基因轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)研究奠定重要的候選標(biāo)記, 還為該技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供了重要經(jīng)驗(yàn)。

關(guān)于利用RNA Pol II CTD蛋白作為分子標(biāo)記來做免疫熒光的研究在許多生物中均已有所報(bào)道。例如, 在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中, 通過免疫熒光顯色將RNA聚合酶II大亞基RPB1定位于細(xì)胞核核漿, 發(fā)現(xiàn)少量RPB1與燈刷染色體的轉(zhuǎn)錄單位有關(guān), 并在RNA Pol II CTD（S2）和RNA Pol II CTD（S5）上發(fā)生磷酸化[20]。在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中, 通過磷酸化的RPB1的免疫熒光染色體定位, 檢測到p-RNA Pol II CTD（S2）準(zhǔn)確定位于微管組織中心（microtubule-organizing center, MTOC）和著絲粒中；p-RNA Pol II CTD（S5）與減數(shù)分裂過程中紡錘體的微管保持共同定位, 并維持紡錘體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；p-RNA Pol II CTD（S7）與微管的聚合狀態(tài)有關(guān)[21]。在哺乳動(dòng)物（人和小鼠）細(xì)胞中, 通過免疫熒光試驗(yàn)檢測到p-RNA Pol II CTD（T4）與RNA Pol II的超磷酸化形式（Pol IIO）密切相關(guān), 推測其可能參與了基因轉(zhuǎn)錄延伸的調(diào)控[22]。在小鼠的精巢組織中, 通過免疫組化檢測到p-RNA Pol II CTD（S5）抗體于小鼠每一類生殖細(xì)胞中均有陽性反應(yīng), 直至第8階段精子細(xì)胞；而在人類精巢組織中, 于精母細(xì)胞粗線期到第3階段精子細(xì)胞有陽性反應(yīng), 其余階段無陽性反應(yīng)[23]。目前為止, 很少有在魚類中進(jìn)行的RNA Pol II CTD蛋白定位研究。本研究在鯉細(xì)胞中對RNA Pol II CTD（S5）蛋白免疫熒光FISH進(jìn)行開創(chuàng)性探索試驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)與RNA Pol II CTD（S5）蛋白關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)數(shù)在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞不同階段均呈現(xiàn)出規(guī)律性分布, 該結(jié)果可直接反映出魚類生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄活躍性, 并且熒光位點(diǎn)數(shù)目與染色體數(shù)目具有一定的關(guān)聯(lián)性, 在魚類多倍化研究方面也具有重要的意義。