Aβ1-42對大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞酸敏感離子通道的表達(dá) 和電生理特性的影響

余曉巍, 蔡 拓, 詹麗超, 朱嘯川, 葉生寶, 葛行義*

（1. 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點實驗室, 湖南大學(xué)生物學(xué)院, 長沙 410082；2. 湖南省職業(yè)病防治院, 長沙 410003）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病, 表現(xiàn)為緩慢而漸進(jìn)式的記憶障礙, 進(jìn)而隨時間的推移演變?yōu)椴豢赡娴恼J(rèn)知損傷和執(zhí)行功能喪失, 對患者的生活質(zhì)量造成了極大的影響。β淀粉樣蛋白（amyloid β, Aβ）聚集形成的老年斑被認(rèn)為是AD的典型病理特征之一[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的固有免疫細(xì)胞, 在AD的早期階段Aβ激活小膠質(zhì)細(xì)胞使得其發(fā)揮清除腦部Aβ, 阻止Aβ斑塊形成的功能[2-6]。隨著AD病理進(jìn)程的發(fā)展, 腦部固有免疫系統(tǒng)的激活并不足以有效地清除Aβ[7]。在Aβ持續(xù)慢性刺激作用下, 小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化, 釋放大量炎性細(xì)胞因子, 如TNF-α、IL-1β、活性氧（reactive oxygen species, ROS）等[8]。Aβ的不斷聚集與炎性過程之間形成正反饋通路, 導(dǎo)致了慢性炎癥反應(yīng), 最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡[9]。

炎癥時常伴有組織的酸化[10]。酸敏感離子通道（acid-sensing ion channel, ASIC）作為一種配體門控型離子通道, 其主要特性便是感受胞外pH值下降, 被激活后主要對Na+和Ca2+有通透性, 從而形成內(nèi)向電流, 導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化, 產(chǎn)生興奮性效應(yīng)[11]。

Aβ由β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein, APP）經(jīng)γ-分泌酶和β-分泌酶的蛋白水解而來, 主要有Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43三種類型[12]。大量研究表明, Aβ1-42寡聚體對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用較強(qiáng), 低濃度的Aβ1-42寡聚體就可以直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[13], 且Aβ1-42具有較強(qiáng)的疏水性, 容易促使Aβ纖維的聚集形成老年斑, 更能模擬AD的發(fā)展過程[14]。本研究擬通過觀察Aβ1-42暴露對原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC電生理特性的影響, 以期為Aβ1-42聚集導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷提供可能的應(yīng)對策略。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

出生1～2 d內(nèi)的SD大鼠（Sprague-Dawley rats）購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[SCXK（湘）2019-0014] 。本研究經(jīng)實驗動物使用與管理委員會（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）批準(zhǔn)[湘職防（2019）倫研批003號] , 在湖南省職業(yè)病防治院毒理學(xué)實驗室[SYXK（湘）2017-0001] 進(jìn)行試驗。

1.2 主要試劑

Aβ1-42購自強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司；ASIC1、ASIC2a和ASIC3抗體、OX42、Hoechst 33258購自英國Abcam公司；阿米洛利（amiloride）和Psalmotoxin 1（PcTx1）購自美國Sigma公司；Fura-2/AM熒光探針購自美國Biotium公司；熒光標(biāo)記二抗購自北京中山生物有限公司, 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）和羅丹明購自美國Pierce公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）、胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Hylone公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠皮層原代小膠質(zhì)細(xì)胞的制備

取健康的新生SD大鼠乳鼠, 用75%酒精消毒皮膚, 在無菌環(huán)境下迅速開顱取腦, 放入裝有預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）的無菌培養(yǎng)皿中清洗并仔細(xì)剔除腦膜及血管, 分離大腦皮質(zhì)并充分剪碎后, 置于0.125%胰蛋白酶消化液中于37℃消化20 min。待組織變成絮狀半透明狀后終止消化, 200目尼龍濾網(wǎng)過濾后1 000 r/min離心7 min, 棄上清, 加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀成混懸液, 接種于預(yù)先涂布多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中, 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后全量換液, 此后每3 d換液1次。原代培養(yǎng)至第14天, 更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基后將培養(yǎng)瓶旋緊密封, 固定于37℃恒溫水平搖床內(nèi)220 r/min振蕩3 h, 收集細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中, 1 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基去除未貼壁細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 蛋白免疫印跡試驗

將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板, 每個培養(yǎng)皿接種1×105個細(xì)胞, 將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 待細(xì)胞貼壁后分別加入0、5、20 μmol/L的Aβ1-42處理24 h, 經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞, 提取總蛋白。按BCA蛋白測定說明書對蛋白含量進(jìn)行測定后, 進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后, 250 mA、100 min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane, NC）上, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h后, 用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline Tween-20, PBST）洗膜3次, 每次10 min；將NC膜放入稀釋好的ASIC1抗體（1∶500）中, 4℃過夜；次日用PBST漂洗NC膜3次, 每次10 min, 然后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）中, 室溫孵育1 h；再次用PBST漂洗NC膜3次, 每次10 min；加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（enhanced chemiluminescence, ECL）孵育5 min后, 將NC膜置于化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行檢測。試驗重復(fù)3次（n=3）。

1.3.3 免疫熒光標(biāo)記試驗

將種有細(xì)胞的玻片放入24孔板, 20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 用4%的多聚甲醛固定30 min, 0.01 mol/L PBS浸洗3次, 每次10 min, 0.3% Triton X-100室溫孵育30 min進(jìn)行透化處理, 再加3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）室溫封閉30 min；加入ASIC1抗體（1∶50）, 4℃過夜；次日, 用0.01 mol/L PBS浸洗3次, 每次10 min, 加入FITC或羅丹明標(biāo)記的熒光二抗（1∶50）, 室溫孵育1 h, 0.01 mol/L PBS浸洗3次, 每次10 min；再加入Hochest 33258孵育30 min染核；15%甘油封片后, 置于奧林巴斯FV1000熒光顯微鏡下觀察、拍照。采用奧林巴斯FV10-ASW顯微攝影圖像分析系統(tǒng)攝取免疫熒光圖像, 隨機(jī)測定5個視野細(xì)胞熒光強(qiáng)度, 試驗重復(fù)5次（n=5）。

1.3.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄

將種有細(xì)胞的玻片放入24孔板中, 20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 棄去培養(yǎng)液, 加入適量的細(xì)胞外液, 在倒置相差顯微鏡下選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗。將電極尖端移入細(xì)胞外液, 入水前將玻璃微電極內(nèi)給予正壓, 調(diào)節(jié)液接電位使其歸到零線。當(dāng)電極尖端接觸到細(xì)胞膜表面時, 電極電阻會出現(xiàn)輕度增加, 此時釋放正壓, 輕微施加負(fù)壓, 可見示波器上測試脈沖逐漸減小, 形成高阻抗封接, 并出現(xiàn)幅值相同方向相反的電容瞬流。調(diào)節(jié)電容補償按鈕抵消瞬時的電容電流, 然后給予負(fù)壓抽吸打破細(xì)胞膜, 形成全細(xì)胞記錄模式。此時示波器上出現(xiàn)較大的來自細(xì)胞膜的跨膜電容瞬流。再進(jìn)行串聯(lián)電阻補償和全細(xì)胞電容補償。將小膠質(zhì)細(xì)胞鉗制在膜電位附近, 通過多管灌流系統(tǒng)快速改變鉗制細(xì)胞微環(huán)境的pH值至6.0, 持續(xù)5 s, 記錄酸誘導(dǎo)的電流。電流信號通過模/數(shù)（A/D）轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù), 試驗重復(fù)5次（n=5）。

1.3.5 鈣離子熒光成像測定

將種有細(xì)胞的玻片放入24孔板中, 20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 棄去培養(yǎng)液, 鈣外液漂洗3遍；取1 μL濃度為1 mmol/L的Fura-2/AM熒光探針儲存液加入1 mL細(xì)胞外液, 混勻后加入試驗皿中, 37℃避光孵育30 min；鈣外液漂洗3遍后, 加入1 mL細(xì)胞外液, 在倒置相差顯微鏡下選擇狀態(tài)良好、分散均勻的細(xì)胞, 通過多管灌流系統(tǒng)快速改變細(xì)胞微環(huán)境的pH值至6.0, 持續(xù)5 s, 分別以340 nm和380 nm的熒光進(jìn)行激發(fā), 利用Fura-2/AM熒光探針將細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化轉(zhuǎn)化為熒光信號。以F340/F380熒光強(qiáng)度比值表示細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。系統(tǒng)自動實時監(jiān)測, 數(shù)據(jù)由TILLVISION軟件進(jìn)行記錄和分析, 試驗重復(fù)6次（n=6）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 Aβ1-42暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1、ASIC2a、ASIC3蛋白表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)的影響

蛋白免疫印跡試驗結(jié)果顯示：小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1的蛋白表達(dá)水平隨Aβ1-42濃度的增加明顯增加, 在5、20 μmol/L Aβ1-42濃度下, 其表達(dá)量分別增加約1倍、2倍, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；ASIC2a和ASIC3的蛋白表達(dá)水平, 在5、20 μmol/L Aβ1-42濃度下均無顯著變化（圖1）。

免疫熒光試驗結(jié)果顯示, 20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜖? 表現(xiàn)為突起回縮和形態(tài)變圓。細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中ASIC1的總相對熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng), 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

2.2 Aβ1-42暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1電流特性的影響

通過多管灌流系統(tǒng)實現(xiàn)pH由7.4到6.0的快速轉(zhuǎn)換, 將電壓鉗制在 80 mV, 記錄到了典型的ASIC樣電流, 對照組電流密度為（19.58±3.05）pA/pF；20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 電流密度增強(qiáng)為（50.03±5.37）pA/pF, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；給予100 μmol/L的ASIC非特異性阻斷劑阿米洛利或10 nmol/L的ASIC1特異性阻斷劑PcTx1預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞5 min, 電流可被明顯抑制, 電流密度分別為（13.78±1.82）pA/pF和（25.25±1.99）pA/pF, 抑制率分別為（71.13±5.16）%和（45.44±1.46）%, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05或P＜ 0.01）（圖3）。

2.3 Aβ1-42暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC鈣離子通透性的影響

通過多管灌流系統(tǒng)實現(xiàn)pH由7.4到6.0的快速轉(zhuǎn)換, 對照組胞內(nèi)鈣離子濃度變化（F340/F380）為（0.41±0.02）；20 μmol/L的Aβ1-42處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后, 胞內(nèi)鈣離子濃度變化（F340/F380）增加為（1.20±0.09）, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；給予100 μmol/L的ASIC非特異性阻斷劑阿米洛利或10 nmol/L的ASIC1特異性阻斷劑PcTx1預(yù)處理5 min, 可抑制胞外酸化引起的小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣升高, 抑制率分別為（71.02±9.25）%和（50.68±10.25）%, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（圖4）。

圖4 Aβ1-42暴露對小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC鈣離子通透性的影響Fig. 4 The effect of Aβ1-42 on the calcium permeability of ASIC in microglia

3 討論

AD的確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明, 但研究證實, 在正常大腦中Aβ的產(chǎn)生和清除處于一個平衡狀態(tài), 該過程失衡導(dǎo)致Aβ的聚集是推進(jìn)AD病理進(jìn)程的根本原因[15-16]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中駐留的免疫細(xì)胞, 大腦任何類型的損傷或疾病導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)都會使靜止的分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨膱A形且有高度吞噬能力, 并能分泌炎性細(xì)胞因子, 在AD的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演著重要角色[17-18]。

炎癥是機(jī)體組織受損時的一種保護(hù)性應(yīng)答, 屬于固有免疫反應(yīng)[19]。炎癥發(fā)生時常常伴有組織的酸化, 即病變處pH值（5.5～7.0）低于正常（7.2～7.4）, 這種低pH環(huán)境被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[20]。ASIC通過感受細(xì)胞外pH的下降被激活, 對Na+和Ca2+的通透形成內(nèi)向電流, 導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化, 產(chǎn)生興奮性效應(yīng), 參與突觸傳遞及可塑性調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶過程[21-22]。

大量研究證實, ASIC1 在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了重要的作用。在自身免疫性腦脊髓炎模型和多發(fā)性硬化患者腦部組織中, 少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突 ASIC1表達(dá)上調(diào), 遺傳性的阻斷ASIC1的表達(dá)可減緩軸索變性, 顯著改善臨床癥狀[23]。ASIC1介導(dǎo)了α-synuclein的自噬性降解, 對1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridiniumion, MPP+）誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用, 提示 ASIC1 可能成為治療帕金森病的重要靶標(biāo)[24]。

已有研究證實, 小膠質(zhì)細(xì)胞功能性表達(dá)ASIC1, 通過感知胞外酸化介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和TNF-α、IL-1β等相關(guān)炎癥因子的釋放, 參與小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答和神經(jīng)炎癥免疫調(diào)節(jié)[25]。而小膠質(zhì)細(xì)胞在清除Aβ的同時可誘發(fā)過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng), 已被視為AD的重要病理指征[26-27]。關(guān)于Aβ對小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1的相關(guān)作用目前尚未見任何報道。本研究發(fā)現(xiàn), 給予Aβ1-42刺激后, 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由靜息時的分枝狀迅速改變?yōu)榫哂懈叨韧淌赡芰Φ陌⒚装蜖? 表明其被活化, 且胞核和胞漿中的ASIC1蛋白表達(dá)水平明顯增加。已有研究表明, ASIC主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜和胞漿中, 便于感知細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化[25]。為了驗證ASIC的功能是否變化, 分別采用全細(xì)胞膜片鉗方法和鈣離子成像技術(shù)觀察和記錄胞外酸化條件下小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC電流和對鈣離子的通透性, 結(jié)果表明, 靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞僅有基礎(chǔ)的電生理特性, 經(jīng)過Aβ1-42刺激后能顯著增強(qiáng)胞外酸化誘導(dǎo)的ASIC電流并使胞內(nèi)鈣增加。ASIC非特異性阻斷劑阿米洛利和ASIC1特異性阻斷劑PcTx1的阻斷效應(yīng)提示, 主要是ASIC1參與了胞外酸化引起的內(nèi)向電流和胞內(nèi)鈣水平升高。其原因可能為Aβ刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后ASIC1的表達(dá)增加, 從而使得ASIC1易于被激活而產(chǎn)生內(nèi)向電流, 并表現(xiàn)出對鈣離子的通透性。

綜上所述, Aβ暴露可活化體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞, 顯著增加ASIC1的蛋白表達(dá), 并表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的電生理特性, 為進(jìn)一步深入研究ASIC1在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化和吞噬Aβ中的作用以及Aβ的神經(jīng)毒性機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。