基于光聲和LIBS雙模態(tài)成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢

胡 洋, 張興超, 胡修玉, 蘇寧寧, 陳加剛, 吳 慧, 修俊山*, 趙 岳*

（1. 山東理工大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 淄博 255000；2. 滕州市羊莊中心衛(wèi)生院, 棗莊 277526）

激光在20世紀(jì)被人類發(fā)現(xiàn), 是人類重大科技發(fā)明之一, 它具有很多優(yōu)點, 如方向性好、亮度強(qiáng)和單色性好。所以, 自從被發(fā)明以后, 激光就被應(yīng)用于很多領(lǐng)域, 對人類的社會生活產(chǎn)生了深遠(yuǎn)而廣泛的影響, 與其相關(guān)的各種應(yīng)用也層出不窮。目前, 激光成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是激光領(lǐng)域的一個研究熱點。生物組織具有極度不均勻性, 對光波有著強(qiáng)烈的散射和吸收, 所以光波不能深入生物組織, 也無法得到清晰的圖像。但是, 隨著成像技術(shù)的發(fā)展, 科學(xué)家們研發(fā)出了一系列可以對生物組織進(jìn)行高質(zhì)量成像的方法, 如光聲成像（photoacoustic imaging, PAI）、激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)（laser induced breakdown spectroscopy, LIBS）、熒光顯微成像、光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微成像等, 在腫瘤診斷、血液動態(tài)變化以及細(xì)胞研究等領(lǐng)域已成為有力的新手段。

光聲成像和LIBS是其中應(yīng)用前景比較好的兩種技術(shù)。在1880年, 美國科學(xué)家貝爾首次發(fā)現(xiàn)了光聲效應(yīng), 即周期性的光照射物體時, 會導(dǎo)致物體發(fā)生溫度變化, 引起體積和結(jié)構(gòu)變化, 從而產(chǎn)生超聲波, 而光聲成像基于光聲效應(yīng)[1-2]； Brech等[3]發(fā)現(xiàn)激光激發(fā)會產(chǎn)生等離子體后, LIBS也被開發(fā)出來, 并隨著先進(jìn)激光器的發(fā)明廣泛應(yīng)用起來[4-5]。LIBS和光聲成像都是成像技術(shù), 這兩種成像的方法簡單來說都是利用激光照射樣品, 激光會與樣品表面發(fā)生反應(yīng), 再把這種反應(yīng)想辦法收集表征出來, 就可以呈現(xiàn)出我們所需要的樣品的有關(guān)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)方面的圖樣。但是這兩種成像方法在本質(zhì)上是不同的, 光聲成像是在脈沖激光的照射下, 組織的光吸收域會產(chǎn)生超聲信號, 這就是光聲信號。這種光聲信號攜帶了組織的光吸收特征信息, 再通過探測光聲信號就能把它重建成光吸收分布圖像。光聲成像有著光學(xué)成像高選擇性和超聲成像深穿透性的優(yōu)點, 對組織的成像分辨率和對比度都很高, 可對深層活體組織成像[6-8]。LIBS的原理是, 當(dāng)激光照射在組織上, 激光會燒蝕樣品, 在熔坑附近會電離形成等離子體, 把這些等離子體收集起來, 利用光譜儀就可以形成特征譜線[9-10]。由于原子和離子光譜的波長對應(yīng)特定的元素, 它們具有一定的量化關(guān)系, 通過檢測發(fā)射譜線的波長及強(qiáng)度就可以對樣品中的元素進(jìn)行檢測分析。LIBS對元素有著很好的示蹤作用, 能夠定量分析和獲得大多數(shù)元素的元素圖, 靈敏度和分辨率也很高, 而且樣品制備簡單, 不需要接觸樣品, 是元素映射的有力工具。

綜上所述, 激光照射組織是可以同時產(chǎn)生光聲和LIBS效應(yīng)的。通過檢測光聲信號和等離子體特征譜線, 我們可以得到光吸收分布和元素組成分布。在原理方面, 由于兩種技術(shù)有著相似的激光激發(fā)過程, 通過單一激光脈沖激發(fā)可以得到聲學(xué)以及光譜學(xué)等雙參數(shù)信息；在系統(tǒng)方面, 兩種成像技術(shù)又有著相似的系統(tǒng)組成, 可以實現(xiàn)部分儀器的協(xié)同使用?；诠饴暢上窈蚅IBS成像在原理和系統(tǒng)上的互補(bǔ)性, 將兩種成像技術(shù)有機(jī)結(jié)合, 可以開發(fā)出一種具有雙參數(shù)檢測的光聲和LIBS雙模態(tài)成像系統(tǒng)。此成像系統(tǒng)結(jié)合了兩種技術(shù)的高靈敏、高分辨率以及可對樣品進(jìn)行多參數(shù)分析等優(yōu)勢, 同時提供組織的病理結(jié)構(gòu)和元素表征信息, 在醫(yī)學(xué)影像學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。

1 光聲效應(yīng)及LIBS原理

光聲成像是基于光聲效應(yīng)來進(jìn)行成像的。用一束激光照射樣品時, 樣品內(nèi)部就會吸收光能產(chǎn)生熱量, 導(dǎo)致局部升溫, 由于熱脹冷縮原理, 從而引起樣品熱膨脹產(chǎn)生壓力波。當(dāng)激光脈沖持續(xù)足夠短時, 其產(chǎn)生的信號幅值與光能量的沉積成正比, 波形由光吸收的分布決定。超聲波會從組織內(nèi)部傳到組織外部, 接收探測這種超聲信號就可以重建出樣品的光吸收分布[11]。由于熱膨脹產(chǎn)生超聲波, 首先看熱傳導(dǎo)方程：

在公式（1）中,ρ是密度,T（r,t）是由于吸收光能產(chǎn)生的溫升,Cp為比熱,H（r,t）為單位面積、單位時間吸收的光能量。當(dāng)激發(fā)光源的脈寬小于熱擴(kuò)散時間時, 熱擴(kuò)散就可以忽略, 在滿足熱限制和壓力限制的條件下, 各項同性吸收體內(nèi)光聲壓P（r,t）滿足波動方程, 即：

Cs、β、Cp分別為超聲波在吸收體內(nèi)的傳播速度、等體積膨脹系數(shù)、比熱容。由于光能量沉積H（r,t）是介質(zhì)內(nèi)光吸收分布函數(shù)A（r）與激光脈沖時域函數(shù)I'（t）的乘積函數(shù), 則光聲壓可表示為：

式中r、r′和t分別代表位置和時間。在聲學(xué)特性均勻的介質(zhì)和理想的激光脈沖作用的條件下, 產(chǎn)生的光聲信號的幅值與脈沖激光的幅值成正比, 信號的形狀由光能量的吸收決定。

LIBS利用高能量激光束聚焦在樣品上, 產(chǎn)生激光等離子體, 利用光譜儀采集樣品表面等離子體產(chǎn)生的發(fā)射譜線信號, 以此來實現(xiàn)對樣品的定性和定量分析[12-14]。在LIBS進(jìn)行定性定量分析的過程中, 譜線的強(qiáng)度是特定元素對應(yīng)特定波長的。在計算元素的譜線強(qiáng)度時, 一般需要假設(shè)激光激發(fā)產(chǎn)生的等離子體處于局部熱平衡狀態(tài)。在局部熱平衡狀態(tài)下, 等離子體發(fā)生的過程大多都是碰撞, 此時每個粒子在各能級的分布遵循玻爾茲曼分布, 元素對應(yīng)的譜線強(qiáng)度可由以下公式表示：

式中λ為k、i能級之間躍遷形成的特征譜線波長,NS為粒子數(shù)密度,Aki為k、i兩能級間的躍遷幾率, 表示在單位時間內(nèi)原子在兩個能級之間躍遷的次數(shù)。gk為統(tǒng)計權(quán)重, 表示電子在某一能級軌道上能夠存在的狀態(tài)數(shù)。Ek、k、T、US（T）分別為激發(fā)態(tài)能量、玻爾茲曼常數(shù)、等離子體溫度和分布函數(shù)。在這個公式中,NS和原子發(fā)射譜線強(qiáng)度密切相關(guān), 當(dāng)確定好譜線, 可以得到除NS以外的其他所有參數(shù)[15]。

光聲成像和L I B S成像原理的示意圖如圖1所示。

圖1 光聲成像和LIBS成像原理[13] Fig. 1 Principles of photoacoustic imaging and LIBS imaging[13]

2 光聲成像系統(tǒng)和LIBS成像系統(tǒng)

2.1 光聲成像系統(tǒng)

光聲成像是通過使用單個機(jī)械平移或旋轉(zhuǎn)聚焦傳感器映射光聲信號來實現(xiàn)的。它的優(yōu)勢主要包括在超聲分辨率下檢測內(nèi)源性光學(xué)吸收對比度[16]。圖2顯示了一種光聲成像的系統(tǒng)示意圖。在圖中, 高數(shù)值孔徑光學(xué)透鏡用于將激光束聚焦到組織表面, 光學(xué)透明聲反射器將光聲波引導(dǎo)至超聲換能器。傳感器和激光束一起在平面上進(jìn)行機(jī)械掃描, 吸收的激光輻射導(dǎo)致介質(zhì)熱膨脹, 脈沖激光束弱聚焦到生物組織中, 產(chǎn)生超聲波發(fā)射[17-18]。然后, 用聚焦超聲換能器檢測超聲波, 對檢測到的信號進(jìn)行校正, 形成高分辨率的圖像[19]。

圖2 光聲成像系統(tǒng)示意圖[17] Fig. 2 Schematic diagram of photoacoustic imaging system[17]

2.2 LIBS成像系統(tǒng)

LIBS的優(yōu)點包括易于使用和操作速度快, 其材料采樣、霧化和激發(fā)步驟通過單個激光脈沖同時發(fā)生。此處, 其可以通過在感興趣區(qū)域上掃描樣本表面, 以逐像素的方式獲得元素圖樣。對于逐像素掃描模式, 如圖3的LIBS系統(tǒng)示意圖所示[20], 激光器在同一位置提供多次激光發(fā)射；之后, 樣本按照步長在x（或y）方向移動, 并按照編程順序重復(fù)操作。重復(fù)頻率為10 Hz的納秒紫外線（266 nm）激光脈沖通過物鏡聚焦, 以誘發(fā)材料擊穿。等離子體中發(fā)射的光輻射由導(dǎo)出的光學(xué)系統(tǒng)收集, 并使用配備增強(qiáng)型電荷耦合器件（ICCD）攝像機(jī)的光譜儀進(jìn)行分析[21-22]。

圖3 LIBS系統(tǒng)示意圖[20] Fig. 3 Schematic diagram of LIBS system[20]

綜上所述, 光聲成像系統(tǒng)和LIBS成像系統(tǒng)具有很大的相似性。在設(shè)備方面, 兩種技術(shù)同時需要利用到激光以及掃描平臺等設(shè)備；在掃描方式方面, 兩者都是基于點對點掃描進(jìn)行成像分析, 這都為兩種技術(shù)的結(jié)合提供了良好的基礎(chǔ)。因此, 通過調(diào)整激光功率, 共用同一光源以及掃描平臺, 可以實現(xiàn)同時的光聲和LIBS雙模態(tài)成像。

3 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

光聲成像和LIBS在對組織切片的觀察和成像上都有了廣泛的應(yīng)用。光聲成像可以用來觀察小鼠的腦結(jié)構(gòu), LIBS可用來觀察皮膚組織的成像。圖4a展示了小鼠大腦和小腦切片髓鞘的非標(biāo)記光聲成像圖, 對切片用髓鞘特異性染料勞克堅牢藍(lán)（Luxol fast blue, LFB）進(jìn)行染色, 使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察, 把得到的圖像再和顯示髓鞘（綠色）和核酸（紫色）分布的光聲組織學(xué)光聲顯微鏡圖像進(jìn)行對比, 這兩種圖像顯示了相同的細(xì)節(jié)[23]。LIBS在對皮膚組織成像時, 得到的結(jié)果如圖4b所示, 使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色后的組織可以很容易地識別皮膚的三層（即表皮、真皮和皮下組織）。相關(guān)LIBS元素圖像以從冷到暖的色階顯示。通過觀察發(fā)現(xiàn), 皮膚中的元素具有很強(qiáng)的異質(zhì)性, 結(jié)合對元素分布的綜合分析, 可以正確識別和區(qū)分三種不同的生理皮膚層[24]。以上成像結(jié)果表明, 光聲成像和LIBS成像可以實現(xiàn)對組織切片的吸收特性及元素分布的高分辨成像, 兩種技術(shù)在組織成像領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

光聲成像和LIBS成像不僅可以對組織切片成像, 還可以實現(xiàn)組織中金屬元素的示蹤。光聲成像常用于監(jiān)控活體動物體內(nèi)金屬納米粒子的示蹤。圖5a展示了金納米籠在小鼠皮下黑色素瘤的分布情況。通過向小鼠尾靜脈注射濃度為10 nmol/L的金納米籠, 對比注射0、3、6 h的光聲圖像, 揭示小鼠黑色素瘤內(nèi)金納米籠的聚集情況[25-26]。而LIBS也可以對小鼠腎臟中金屬元素進(jìn)行示蹤。圖5b展示了在對小鼠靜脈注射釓（Gd）基納米顆粒24 h后其腎臟冠狀截面的雙元素成像。由于Na是生物組織的組成成分, 除了大型集合管和血管這種缺乏組織的區(qū)域外, Na信號均勻分布, 而Gd主要在腎皮質(zhì)區(qū)域檢測到, 并且在集合管的外部區(qū)域。放大的截面圖也清楚地表明腎臟周圍存在高水平的Gd[27]。以上結(jié)果表明, 這兩種技術(shù)在探測生物體組織中金屬元素的示蹤方面都有非常成熟的應(yīng)用, 未來還有很大的發(fā)展空間。

4 總結(jié)與展望

在過去的幾十年里, 醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展。光聲成像作為近些年來發(fā)展的一種新的無損醫(yī)學(xué)成像方法, 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有諸多的應(yīng)用, 而LIBS技術(shù)也在觀察組織結(jié)構(gòu)和元素分布等醫(yī)學(xué)研究方面有著很高的應(yīng)用價值。當(dāng)超短脈沖激光經(jīng)聚焦后激發(fā)生物組織時, 組織將產(chǎn)生光聲信號, 生物組織的光聲信號攜帶了組織對光的吸收特性, 通過測量光聲信號能重建出組織的光吸收分布圖像。與此同時, LIBS通過激光聚焦組織表面形成等離子體。利用光譜儀對等離子體發(fā)射光譜進(jìn)行分析, 以此來識別組織中的元素組成成分, 進(jìn)而可以進(jìn)行組織中元素的識別、分類、定性以及定量分析。這兩種成像方式在系統(tǒng)上是非常相似的, 都需要用到激光照射物體以及利用掃描平臺等, 所以兩者可以共用同一臺光源以及掃描平臺實現(xiàn)同時的雙模態(tài)成像?；谒鼈儚脑淼较到y(tǒng)的相似性, 可以很容易地構(gòu)建光聲和LIBS的雙模態(tài)成像系統(tǒng), 如圖6所示。光聲成像的優(yōu)勢在于能夠?qū)崿F(xiàn)活體動物的組織深度成像和功能分子示蹤, 因此, 光聲成像技術(shù)在癌癥、心血管疾病和神經(jīng)疾病方面有著廣泛的應(yīng)用。而傳統(tǒng)的病理樣品制備也可以直接用于LIBS分析, 并可以顯示元素的生物分布, 且與樣品的形態(tài)保持一致。同時, 組織的元素圖像可以表征病變, 正常組織和病變組織元素分布會有所不同。任何具有醫(yī)學(xué)意義的樣本的元素圖像和組織病理學(xué)圖像之間的直接比較也可能有某些元素的關(guān)系, 特別是可能與某些病理學(xué)相關(guān)的生理區(qū)域, 帶來視覺組織病理學(xué)以外的信息。

此外, 在光聲成像和LIBS技術(shù)結(jié)合的應(yīng)用上仍然存在著一些局限性。光聲成像與超聲一樣, 分辨率在物理上會受到成像深度和超聲頻率的反比關(guān)系限制。分辨率會隨著頻率的增加而增加, 但是在更高的頻率下信號衰減會更大, 這就會導(dǎo)致成像深度受到限制, 靈敏度也會受到組織內(nèi)光散射的影響。在分析復(fù)雜樣品時, LIBS在量化和數(shù)據(jù)處理方面具有很大的挑戰(zhàn)性, 由于LIBS成像的機(jī)制是收集等離子體, 故等離子體形態(tài)的波動也會導(dǎo)致成像的不確定性。當(dāng)激光功率比較小的時候, 發(fā)生的是光聲成像, 但當(dāng)激光功率逐漸變大, 逐漸超過檢測物表面的損傷閾值時, 激光射在上面會形成熔坑, 這時主要發(fā)生的是等離子的電離, 但是是否還存在著光聲效應(yīng)仍然存疑。但總體來看, 光聲成像與LIBS成像技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面有著極強(qiáng)的互補(bǔ)優(yōu)勢。結(jié)合兩者優(yōu)點的光聲和LIBS雙模態(tài)成像系統(tǒng), 與其他單系統(tǒng)成像方式對比, 在多尺度、多參數(shù)協(xié)同表征病理方面都有著不小的優(yōu)勢, 二者結(jié)合可以得到光吸收信息、光譜學(xué)信息等不同參數(shù)的表征結(jié)果。納米科技在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛。對生物組織中金屬和有機(jī)離子分布及其他納米粒子示蹤的日益關(guān)注表明, 光聲和LIBS雙模態(tài)成像技術(shù)有望成為無標(biāo)記、多方位成像的一種極有價值的研究工具, 在納米粒子介導(dǎo)的診斷到治療中有著廣闊的應(yīng)用空間, 將成為醫(yī)學(xué)診斷和圖像引導(dǎo)治療的關(guān)鍵工具應(yīng)用于醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域。