白頭翁皂苷注射液對奶牛隱性乳房炎的臨床治療效果

汪培嘉，嚴 靜，王銀龍，蘇柘僮，趙俊卿，許小琴*

(1.揚州大學 獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225000；2.成都馨海英路生物醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610000；3.廣西英路維特藥物有限公司，廣西 荔浦 541000)

奶牛乳房炎是由細菌感染、物理損傷等引起的乳腺組織的炎癥反應。該病主要分為臨床型和隱性型，其中隱性乳房炎的發(fā)病率遠高于臨床型乳房炎的發(fā)病率。近年來，獸醫(yī)臨床上主要使用抗生素防治奶牛乳房炎，然而抗生素的長期使用引發(fā)了細菌耐藥性、抗生素殘留等問題，嚴重危害公共安全，因此在臨床上，抗生素受到了限用甚至禁用。中草藥因具有藥用、保健等功能以及不易導致耐藥性的特點[1]，而逐漸成為獸醫(yī)工作者研究的熱點。多種中藥制劑被證實對奶牛隱性乳房炎有較好的臨床治療效果[2-4]，因此選取中藥對奶牛隱性乳房炎進行防治與當下需求非常吻合。白頭翁皂苷B4是白頭翁皂苷注射液的主要有效成分，它是從中藥白頭翁的根中提取出的一種天然皂苷，具有顯著的生物活性。現(xiàn)代藥理學研究表明，白頭翁皂苷B4具有抑菌、抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫功能等作用[5-8]。沈留紅等[9]將白頭翁皂苷B4用于奶牛臨床型乳房炎的治療，證實以0.05 mL/(kg·d)的劑量連續(xù)給藥6 d，能夠有效治療奶牛臨床型乳房炎，治愈率可達75.00%。據此，我們認為白頭翁皂苷B4對奶牛隱性乳房炎可能具有潛在的治療價值，故選擇白頭翁皂苷注射液按0.05 mL/(kg·d)作為中劑量開展了對奶牛隱性乳房炎的治療。

本試驗旨在探究白頭翁皂苷注射液對奶牛隱性乳房炎的臨床療效，及部分藥效機制，以期對奶牛隱性乳房炎的防治和白頭翁皂苷B4的研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.1.1受試藥物 白頭翁皂苷注射液，100 mL/瓶，主要成分為白頭翁皂苷B4(質量濃度為33.5 g/L)，批號：20201101，由廣西英路維特藥物有限公司提供。

1.1.2陽性對照藥物 雙丁注射液，肌內注射，給藥量根據奶牛體質量0.1 mL/kg，規(guī)格10 mL/支(相當于原生藥18 g)，10 支/盒，由河北遠征禾木藥業(yè)有限公司生產，批號EPC200501。

1.1.3其他 奶牛乳房炎檢測試劑(HMT)，25 g/瓶，批號200510，由浙江大學食品科學與發(fā)酵工程研究所提供；生化試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，其他常規(guī)試劑均為國產分析純級產品。

1.2 主要儀器FOSS多功能乳制品分析儀(MilkoScan FT1，丹麥)、福斯原奶細菌與體細胞快速檢測一體機(BacSomatic BS型，丹麥)、乳房炎塑料診斷盤(興牧荷斯坦畜牧機械廠)、Sartorius電子天平(BSA223S-CW，德國)、賽恩斯磁力攪拌機(MS-H280-Pro，中國)、Eppendorf多功能臺式離心機(5811 dG271611，德國)等。

1.3 奶牛隱性乳房炎的診斷參考鐘英杰等[2]的方法，于擠奶前進行奶牛隱性乳房炎的診斷，并根據表1判定隱性乳房炎炎癥度，判定為可疑的乳樣應重復測定1次，如結果仍為可疑則判定為陰性。為了便于統(tǒng)計，將HMT檢測的乳房炎判定標準“+、++、+++”分別用分數“1分、2分、3分”表示，每頭牛取4個乳區(qū)檢測的得分總和為炎癥度積分指標。奶牛及其乳房無肉眼可見的異常變化，隱性乳房炎炎癥度積分>1分的判為患隱性乳房炎奶牛[2]，其中隱性乳房炎炎癥度積分≥3分的奶牛選為治療試驗動物。

表1 杭州乳房炎試驗(HMT)判定標準

1.4 實驗動物與處理選擇揚州市某奶牛場為試驗牧場，場內奶牛品種為荷蘭黑白花奶牛。選擇該場經產3～6胎，處于泌乳期，符合奶牛隱性乳房炎診斷標準和試驗納入標準的自然患隱性乳房炎奶牛103頭，確認患牛最近1月內未用過任何藥物后，按牛存欄編號隨機分為5組，分別為白頭翁皂苷注射液高劑量組(受試藥物高劑量組)、白頭翁皂苷注射液中劑量組(受試藥物中劑量組)、白頭翁皂苷注射液低劑量組(受試藥物低劑量組)、陽性藥物對照組(陽性藥物對照組、雙丁注射液組)和陽性對照組(生理鹽水組)。各組于每天上午8～9點間經肌肉注射給藥，1 次/d，連用5 d。于給藥前1 d、給藥后3 和5 d，分別用HMT檢測各試驗?；茧[性乳房炎的炎癥度積分，并于給藥前1 d和給藥后5 d，分別采集各奶牛4個乳區(qū)的乳樣各50 mL，送至揚大康源乳業(yè)乳品檢測實驗中心進行體細胞含量的檢測和乳蛋白、乳糖、非脂固形物和乳密度等乳成分理化指標的測定；采集各頭牛的靜脈血進行血常規(guī)、炎性因子和免疫因子的檢測。經綜合分析各項指標來考察試驗藥物的療效。具體分組及處理情況見表2。

表2 各試驗組處理情況

1.5 治療效果判斷標準根據HMT檢測結果進行藥物治療效果的判定，治療效果分痊愈、有效和無效[2]，具體標準如下：

治療后炎癥度積分為0，且全身無肉眼可見的病理現(xiàn)象者，判為痊愈。治療后炎癥度積分下降2分以上，且炎癥度積分≤6分，全身無肉眼可見的病理現(xiàn)象者，判為有效。治療后患病奶牛全身雖無肉眼可見的病理現(xiàn)象，但經HMT檢測，其隱性乳房炎炎癥度積分下降≤2分，或4個乳區(qū)的炎癥度積分>6分；或1個乳區(qū)以上轉變?yōu)榕R床型乳房炎者，判為無效。

治愈率%=(該組痊愈牛頭數/該組治療牛頭數)×100；

有效率%=(該組有效牛頭數/該組治療牛頭數)×100；

無效率%=(該組無效牛頭數/該組治療牛頭數)×100；

總有效率%=治愈率%+有效率%。

1.6 數據統(tǒng)計分析乳成分理化指標、血常規(guī)指標用“平均數±標準差”表示，用SPSS 25.0軟件，經t檢驗統(tǒng)計分析各組間的差異性。痊愈率、有效率、總有效率和無效率，用卡方檢驗比較各組間的差異性[2]。

2 結果

2.1 臨床試驗的隱性乳房炎治療效果所有試驗組經1次/d，連續(xù)給藥5 d，并于給藥前1 d、給藥后3 和5 d進行HMT診斷液檢測從而判斷臨床治療效果。結果顯示，給藥后3 d，受試藥物高劑量組、受試藥物中劑量組、受試藥物低劑量組、雙丁注射液組和陽性對照組的總有效率分別為81.82%，67.74%，45.45%，40.00%,29.17%，其中受試藥物高劑量組的總有效率與陽性對照組的總有效率相比差異極顯著(P<0.01)，與受試藥物低劑量組、雙丁注射液組的總有效率相比差異顯著(P<0.05)，同時受試藥物高劑量組的治愈率最高為18.18%，顯著高于受試藥物低劑量組治愈率0.00% (P<0.05)。給藥后5 d，受試藥物高劑量組、受試藥物中劑量組、受試藥物低劑量組、雙丁注射液組和陽性對照組的總有效率分別為90.91%，77.42%，77.27%，46.67%，33.33%，其中受試藥物高、中劑量組的總有效率顯著高于雙丁注射液組的總有效率 (P<0.05)，受試藥物高劑量組、中劑量組、低劑量組3個治療組的總有效率與陽性對照組的總有效率相比差異均極顯著(P<0.01)，同時受試藥物中劑量組的治愈率最高為16.13%，顯著高于受試藥物低劑量組治愈率0.00% (P<0.05)。將各組給藥后3和5 d的總有效率進行比較，其中受試藥物低劑量組給藥后3和5 d的總有效率差異性顯著(P<0.05)，其余各組給藥后3和5 d的總有效率差異性不顯著(P>0.05)。將各組給藥后3和5 d的治愈率進行比較，差異性均不顯著(P> 0.05)。詳細結果見表3。

表3 臨床試驗的奶牛隱性乳房炎治療結果

2.2 臨床試驗治療前后炎癥度積分變化治療前，所有組別患病牛的炎癥度積分均值皆在6.09以上。給藥3 d后，與用藥前炎癥度積分均值相比，受試藥物高、中、低劑量組、雙丁注射液組和陽性對照組的炎癥度積分均值分別下降了2.91，2.39，1.75，1.47，1.04，且受試藥物高、中、低劑量組炎癥度積分均值皆不高于陽性對照組炎癥度積分均值5.11。給藥后5 d，與用藥前炎癥度積分均值相比，受試藥物高、中、低劑量組、雙丁注射液組和陽性對照組的炎癥度積分均值分別下降了3.18，3.05，2.66，1.46，1.61，且受試藥物高、中、低劑量組炎癥度積分均值皆低于陽性對照組炎癥度積分均值4.54。受試藥物高劑量組炎癥度積分均值下降最多，并且受試藥物高劑量組給藥前1 d和給藥后3和5 d炎癥度積分差異顯著(P<0.05)，受試藥物中劑量組給藥前4 d和給藥后3和5 d炎癥度積分差異極顯著(P<0.01)，受試藥物低劑量組給藥后5 d炎癥度積分極顯著高于用藥前(P<0.01)。結果見圖1。

*表示差異顯著(P<0.05)，** 表示差異極顯著(P<0.01)，***表示差異極顯著(P<0.001)。下同

2.3 臨床試驗治療前后乳樣體細胞數變化比較治療前各組受試牛乳樣中的平均體細胞數，各組數值基本接近，與各組平均炎癥度積分所反映的情況亦相一致。連續(xù)肌肉注射給藥治療5 d后，受試藥物高、中、低劑量組的乳樣體細胞數與治療前的乳樣體細胞數相比分別出現(xiàn)了顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)和極顯著(P<0.01)下降。而雙丁注射液組乳樣體細胞數雖有所下降，但無顯著性差異(P>0.05)，結果見圖2。

圖2 臨床試驗治療前后各組乳樣中體細胞數變化

2.4 臨床試驗治療后乳成分測定結果見表4。由表可知，治療后，各組乳脂、乳蛋白、乳糖、非脂固形物和乳密度無顯著差異(P>0.05)。

表4 臨床試驗治療后乳成分測定結果

2.5 臨床試驗血液學指標的測定比較治療前與治療后各試驗組奶牛血常規(guī)檢測結果，各項檢測指標的變化均沒有顯著性差異，且所有測定數據均在奶牛血液學指標的正常參考值范圍內。

2.6 臨床試驗血清中IL-8、IL-1β、IgG、IgM、HP的含量檢測結果顯示，治療后IgM在奶牛血清中的含量，受試藥物高劑量組顯著低于雙丁注射液組 (P<0.05)；治療后IL-8在奶牛血清中的含量，受試藥物高劑量組顯著高于受試藥物低劑量組 (P<0.05)，受試藥物高劑量組極顯著高于陽性對照組 (P<0.01)，結果見圖3。

圖3 臨床試驗治療前后奶牛血清中IL-8、IL-1β、IgG、IgM、HP的含量

3 討論

3.1 診斷標準本試驗采用HMT檢測試劑作為奶牛隱性乳房炎的臨床快速診斷標準，并與FOSS-BacSomatic BS型體細胞檢測儀對乳樣的細胞檢測數據進行比較，按臨床診斷標準和試驗納入標準的患隱性乳房炎奶牛，每頭牛4個乳區(qū)的隱性乳房炎炎癥度積分在3.5分以上，各組的平均炎癥度積分在5.55～6.09之間，其乳樣的平均體細胞數約為357 萬/mL，即本次試驗HMT檢測的隱性乳房炎1個“+”即炎癥度1分的平均體細胞數約為59.5 萬/mL，恰好處于診斷標準中弱陽性(+)，即體細胞數在40～150 萬/mL之間，符合試驗設計判定標準[10]，表明試驗選用的HMT檢測試劑所開展的臨床快速檢測診斷標準可行，入選的患隱性乳房炎的奶牛符合試驗要求。

SCC是指每毫升牛乳中含有的細胞總數，其中98%～99%為淋巴細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞，還有少量壞死脫落的乳腺上皮細胞等[11]。有研究表明，SCC與奶牛健康狀況、牛乳質量密切相關，當奶牛乳房出現(xiàn)由組織損傷、細菌感染等引起的炎癥時，乳腺上皮細胞中的巨噬細胞、中性粒細胞等免疫相關細胞大量聚集，導致SCC出現(xiàn)顯著增加[11-12]。因此，SCC現(xiàn)為國內外判定隱性乳房炎的重要指標[12-15]。

3.2 結果分析本試驗發(fā)現(xiàn)，對患隱性乳房炎的奶牛以0.08 mL/(kg·d)的劑量肌肉注射白頭翁皂苷注射液，連續(xù)治療5 d后總有效率最高，可達90.91%。同時，將給藥后3和5 d的治療效果進行對比，各組總有效率皆有所上升。且給藥后5 d，受試藥物高、中劑量組的總有效率顯著高于陽性藥物對照組和陽性對照組的總有效率，受試藥物高、中、低劑量組的隱性乳房炎炎癥程度積分與治療前相比達到了極顯著性(P<0.01)或顯著性(P<0.05)下降，且下降幅度皆大于陽性對照組炎癥度積分下降幅度。因此連續(xù)給藥5 d為1個療程的治療效果更佳。本試驗結果表明，經白頭翁皂苷注射液治療后，受試藥物高、中、低劑量組的SCC與治療前各組SCC相比出現(xiàn)了顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)下降。這與沈留紅等[9]使用白頭翁皂苷B4治療臨床性乳房炎后，牛乳中SCC顯著降低的結果相似。治療后，雙丁注射液組乳樣體細胞數雖有所下降，但無顯著性差異(P>0.05)，而有研究發(fā)現(xiàn)，患隱性乳房炎的奶牛經雙丁注射液與魚腥草注射液聯(lián)用治療后，SCC顯著下降(P<0.05)[16]。這表明白頭翁皂苷注射液對奶牛隱性乳房炎有較好的臨床治療效果，而雙丁注射液單獨使用時，對奶牛隱性乳房炎的治療效果不理想。

奶牛隱性乳房炎是最常見的奶牛疾病之一，該病的發(fā)生對牛乳品質帶來了極大的影響[17-18]。隱性乳房炎的發(fā)生會破壞乳腺組織，導致乳脂、乳糖合成量下降，最終表現(xiàn)為牛乳中乳脂、乳糖含量降低。隱性乳房炎的發(fā)生還會引起乳房毛細血管通透性增加，進而導致乳汁中乳清蛋白含量增加[18]。劉延鑫等[4]研究發(fā)現(xiàn)，使用五味消毒飲對患隱性乳房炎的奶牛進行治療時，治療第7天對照組和治療組各項乳成分指標差異不顯著(P>0.05)，治療第14天僅治療組產奶量顯著高于對照組(P<0.05)。本試驗中，治療后5 d各組間乳脂、乳蛋白、乳糖、非脂固形物和乳密度均無顯著性差異(P>0.05)，與上述試驗結果一致。說明白頭翁皂苷注射液在短期內對患隱性乳房炎奶牛的乳成分影響較小。

細胞因子是機體在炎癥過程中進行調節(jié)的重要因素，當奶?；茧[性乳房炎時，機體免疫細胞受到刺激，釋放細胞因子，導致患病奶牛體內細胞因子含量增加[19]。有研究表明，當奶?；茧[性乳房炎時，細胞因子HP、IL-1β、IL-8的基因表達水平顯著上升[20-21]。沈留紅等[9]發(fā)現(xiàn)，經白頭翁皂苷B4治療后，患臨床型乳房炎的奶牛血清中HP、IL-1β、IL-8含量顯著降低。胡屹屹等[22]發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷B4可顯著降低由細菌內毒素引起的內皮細胞IL-8分泌增加。本試驗結果顯示，治療后，各組患隱性乳房炎的奶牛血清中HP和IL-1β含量均無顯著變化，僅治療后IL-8在奶牛血清中的含量受試藥物高劑量組極顯著高于陽性對照組(P< 0.01)，與上述試驗結果不一致。同時對血液學常規(guī)指標和血清中IgG、IgM等免疫指標進行檢測，結果顯示經白頭翁注射液治療后，這些指標未出現(xiàn)顯著變化。表明肌肉注射白頭翁皂苷注射液連續(xù)5 d，對患隱性乳房炎奶牛的基礎生理代謝活動影響較小。

綜上所述，白頭翁皂苷注射液，按奶牛體質量0.08 mL/kg 肌肉注射， 1次/d，連續(xù)5 d，對奶牛隱性乳房炎具有較好的治療效果，且明顯優(yōu)于雙丁注射液的療效。