枯草芽孢桿菌復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)雞壞死性腸炎回腸黏膜損傷的預(yù)防作用

鄭夢(mèng)琳，朱陽(yáng)華，趙慧玲，王柏森，高艷梅，謝長(zhǎng)清*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 動(dòng)物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.武漢新聯(lián)大生物有限公司，湖北 咸寧 437222)

雞壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)是由產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，CP)引起的一種以回腸組織病變?yōu)橹鞯哪c道疾病。目前，在全世界范圍內(nèi)，肉雞NE已經(jīng)成為影響?zhàn)B禽業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。自2006年以來(lái)，隨著抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)以及對(duì)人類(lèi)的傳播，歐盟禁止抗生素進(jìn)入動(dòng)物養(yǎng)殖中；2020年7月，我國(guó)也出臺(tái)相關(guān)政策禁止飼料中使用抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑，使得肉雞NE的防治問(wèn)題變得更加突出。因此，尋找非抗生素替代品來(lái)控制該病已成為養(yǎng)禽業(yè)非常關(guān)注的問(wèn)題。有關(guān)研究表明，疫苗、噬菌體、益生菌、酸化劑、卵黃抗體、植物精油和植物提取物等是有效的替抗產(chǎn)品[1-2]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于預(yù)防NE的抗生素替代物研究主要集中在微生態(tài)制劑及疫苗的研究，研究表明飼料中添加枯草芽胞桿菌PB6可顯著提高肉雞成活率和減輕CP的感染程度[3]；添加地衣芽孢桿菌H2能提高肉雞生長(zhǎng)性能和調(diào)節(jié)由NE導(dǎo)致的菌群失調(diào)[4]；添加約氏乳桿菌BS15可提高小腸消化吸收能力、腸道免疫水平以及抗氧化能力，從而預(yù)防由CP引起的亞臨床NE[5]。以上研究均證明微生態(tài)制劑能夠成為預(yù)防NE的抗生素替代物。本試驗(yàn)選取由武漢新聯(lián)大生物有限公司研發(fā)的以枯草芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑1以及枯草芽孢桿菌低溫發(fā)酵產(chǎn)物為主的微生態(tài)制劑2，利用CP感染肉雞建立NE模型，研究日糧添加對(duì)感染CP肉雞的回腸黏膜損傷的預(yù)防作用，為其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑1日齡健康817雛雞60只，購(gòu)自襄陽(yáng)正大農(nóng)牧有限公司;基礎(chǔ)日糧選購(gòu)510肉小雞正大飼料;產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP-0/CP-7)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，臨用前用FTG(液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基)增菌培養(yǎng)至108CFU/mL;微生態(tài)制劑由武漢新聯(lián)大生物有限公司提供，其中微生態(tài)制劑1主要成分：枯草芽胞桿菌、酵母、香芹酚、百里香酚、肉桂醛等;微生態(tài)制劑2主要成分：枯草芽胞桿菌及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物;總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1 法)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(ABTS法)購(gòu)自南京建成生物研究所;CHICKEN IGA ELISA，sIgA購(gòu)自美國(guó)Bethyl laboratories Inc公司。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建動(dòng)物試驗(yàn)遵循《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的規(guī)定，雛雞入舍前洗凈料盤(pán)和飲水器，用福爾馬林和高錳酸鉀熏蒸雞舍24 h后通風(fēng)1周。試驗(yàn)雞采用籠養(yǎng)，日糧中添加6%甘氨酸，自由采食和飲水。將60只1日齡健康817雛雞隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組(Control組),微生態(tài)制劑1組(MEA 1組),微生態(tài)制劑2組(MEA 2組),壞死性腸炎感染組(NE組)，具體分組見(jiàn)表1。于14日齡開(kāi)始攻菌(2 mL新鮮菌液灌胃)，連續(xù)攻菌后3 d處死。對(duì)肉仔雞回腸組織進(jìn)行取樣。將回腸組織于4%甲醛中固定，用于組織病理學(xué)觀察和絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比分析；同時(shí)取回腸組織10 cm，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物后刮取其黏膜-20℃冰箱保存，用于檢測(cè)回腸黏膜的抗氧化水平和sIgA含量；同時(shí)取回腸約2 cm，-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量。

1.3 回腸組織病理學(xué)觀察和絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比分析將4%甲醛溶液固定好的回腸組織制成常規(guī)石蠟切片，厚3 μm,采用HE染色法觀察回腸組織的病理變化。采用Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡及高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)對(duì)每張組織切片選取測(cè)量結(jié)構(gòu)完整的5根絨毛長(zhǎng)度(villus length，VL)和5個(gè)隱窩深度(crypt depth，CD)，進(jìn)行VL/CD檢測(cè)分析。

表1 試驗(yàn)分組

1.4 回腸黏蛋白面積率測(cè)定將上述制備好的石蠟切片經(jīng)六胺銀染色法，采用Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡及Image J圖像處理軟件對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行灰度分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量陽(yáng)性信號(hào)面積占所測(cè)視野的百分比即黏蛋白(Mucin，MUC)面積率。

1.5 回腸黏膜抗氧化指標(biāo)檢測(cè)和sIgA含量測(cè)定稱(chēng)取約0.3 g腸黏膜組織按1∶9(W/V)加入PBS緩沖液中，冰浴后勻漿2 min，4℃、1 500 r/min離心10 min，取適量上清液,按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)對(duì)回腸黏膜的T-SOD活性、T-AOC活性進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)按照CHICKEN IGA ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)，對(duì)回腸黏膜的sIgA含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 回腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量檢測(cè)根據(jù)TRIzol方法提取上述凍存于-80℃的回腸組織的RNA，使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度合格后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后的cDNA置于-20℃保存。參照文獻(xiàn)[6]合成PCR引物(表2)。以Real-time PCR檢測(cè)空腸細(xì)胞緊密連接蛋白閉合蛋白(claudin，CLDN)-1、閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZO)-1和ZO-2基因的mRNA表達(dá)情況。擴(kuò)增體系：cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL，2×chamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 4.5 μL。加完體系后瞬時(shí)離心，反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性 5 min；進(jìn)入循環(huán)，95℃ 5 s，56℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，溶解曲線從 65℃升高到 95℃，每5 s升高 0.5℃。

表2 Real-time PCR引物序列表

2 結(jié)果

2.1 回腸組織病理學(xué)觀察回腸HE染色觀察結(jié)果如圖1所示，Control組(圖1A)回腸絨毛完整，排列整齊；MEA 1組(圖1B)與MEA 2組(圖1C)與Control組無(wú)顯著性差異；NE組(圖1D)回腸絨毛顯著縮短，固有層增厚且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮異染，壞死脫落。

A.Control組；B.MEA 1組；C.MEA 2組；D.NE組

2.2 不同處理組回腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度差異如表3所示，NE組回腸絨毛長(zhǎng)度顯著低于Control組，隱窩深度顯著高于Control組(P<0.05)，MEA 1組、MEA 2組VL/CD比值顯著高于NE組(P<0.05)，與Control組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 肉仔雞回腸VL/CD分析 μm

2.3 不同處理組回腸黏蛋白含量差異肉仔雞回腸黏蛋白的面積率測(cè)定結(jié)果如圖2所示，MEA 1組、MEA 2組黏蛋白面積率顯著低于NE組(P<0.05)，與Control組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖2 回腸黏蛋白面積率測(cè)定

2.4 回腸黏膜抗氧化指標(biāo)檢測(cè)如圖3A所示，NE組T-SOD活力顯著低于Control組(P<0.05)，MEA 1組T-SOD活力與NE組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，MEA 2組T-SOD活力略高于NE組，略低于Control組，但差異均不顯著(P>0.05)；如圖3B所示，NE組T-AOC活力顯著低于Control組(P<0.05)，MEA 1組T-AOC活力略高于NE組，略低于Control組，但差異均不顯著(P>0.05)，MEA 2組T-AOC活力顯著高于NE組(P<0.05)，與Control組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 回腸黏膜抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

2.5 不同處理組回腸黏膜sIgA含量差異不同處理組回腸黏膜sIgA含量如圖4所示，MEA 1組略低于Control組、MEA 2組略高于Control組，3組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而3組的sIgA含量均顯著低于NE組(P<0.05)。

圖4 回腸黏膜sIgA含量測(cè)定

2.6 不同處理組回腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量差異如表4所示，MEA 1組、MEA 2組回腸黏膜緊密連接蛋白CLDN-1、ZO-1的mRNA表達(dá)量顯著高于NE組，與Control組無(wú)顯著性差異；NE組回腸黏膜緊密連接蛋白ZO-2的mRNA表達(dá)量顯著低于Control組，MEA 1組、MEA 2組緊密連接蛋白ZO-2的mRNA表達(dá)量顯著高于NE組和Control組。

表4 回腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量測(cè)定 μm

3 討論

目前，隨著我國(guó)飼料抗生素的禁用，尋找一種安全有效的抗生素替代品成為家禽養(yǎng)殖備受關(guān)注的話題之一。近年來(lái)，微生態(tài)制劑經(jīng)常作為一種理想的替抗產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖中，用以減少腸道疾病的發(fā)生率[7]。目前,我國(guó)的研究主要集中在枯草芽孢桿菌等單一益生菌對(duì)雞壞死性腸炎(NE)的預(yù)防作用，而對(duì)于復(fù)合微生態(tài)制劑的研究較少。在本試驗(yàn)中，微生態(tài)制劑1除含有枯草芽孢桿菌外還添加了酵母、香芹酚、百里香酚和肉桂醛等成分。酵母能顯著提高畜禽的消化吸收能力，調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，可作為一種綠色添加劑用于畜禽養(yǎng)殖中[8]；香芹酚、百里香酚和肉桂醛等植物精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有抗菌活性，可提高肉雞生長(zhǎng)性能和胴體品質(zhì)[9-12]；微生態(tài)制劑2主要成分為枯草芽孢桿菌及其低溫發(fā)酵產(chǎn)物，與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)相比，低溫發(fā)酵具有發(fā)酵過(guò)程緩慢、代謝反應(yīng)完全、脂類(lèi)和風(fēng)味物質(zhì)形成豐富的特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于果酒和沼氣的發(fā)酵[13]。張秀玉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在26℃低溫發(fā)酵情況下可以產(chǎn)生具有較高抑菌活性的蛋白；葉云峰等[15]研究發(fā)現(xiàn),在低溫發(fā)酵環(huán)境有利于枯草芽孢桿菌菌體含量的增加。因此，本試驗(yàn)選用這2種以枯草芽孢桿菌為主復(fù)合微生態(tài)制劑，證實(shí)其對(duì)NE回腸黏膜損傷具有預(yù)防作用。

2種復(fù)合微生態(tài)制劑能夠顯著緩解NE所致的回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，維持回腸黏膜完整性。臨床上絨毛長(zhǎng)度/隱窩(VL/CD)深度比是衡量腸道組織消化和吸收能力的重要指標(biāo)，絨毛長(zhǎng)度反映小腸吸收物質(zhì)的速率和程度，隱窩深度反映小腸上皮細(xì)胞生成率[16]。因此，VL/CD值越大，說(shuō)明小腸上皮細(xì)胞成熟率越高、腸絨毛功能越強(qiáng)、腸黏膜消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的面積也越大，更有利于肉雞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。相反，VL/CD值越小說(shuō)明小腸消化吸收能力越弱，生長(zhǎng)更加緩慢，對(duì)疾病的抵抗力也就隨之降低。本試驗(yàn)中NE組絨毛長(zhǎng)度顯著縮短，VL/CD值顯著低于對(duì)照組，微生態(tài)制劑組有所緩解，與組織病理學(xué)觀察結(jié)果一致。益生菌復(fù)合制劑能促進(jìn)肉鴨腸道組織黏膜發(fā)育，使絨毛長(zhǎng)度增加，隱窩深度降低，VL/CD值顯著增加[17]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。緊密連接(tight junctions,TJs)是由跨膜蛋白組成的多蛋白復(fù)合物[18]，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)蛋白與肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架相連，將同一組織的細(xì)胞固定在一起，可以維持細(xì)胞之間聯(lián)系。claudin-1、ZO-1和ZO-2的表達(dá)在腸道上皮，許多腸道致病菌誘發(fā)的腸道病變與緊密連接的破壞有關(guān)，包括腸致病性大腸桿菌(EPEC)、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、幽門(mén)螺桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)膜彎曲桿菌和沙門(mén)氏菌[19]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NE組緊密連接蛋白基因claudin-1、ZO-1和ZO-2表達(dá)量下降而微生態(tài)制劑的加入提高了其表達(dá)量，表明微生態(tài)制劑促進(jìn)了上皮細(xì)胞之間的緊密連接，進(jìn)而維持回腸黏膜的完整性，這與VL/CD檢測(cè)分析結(jié)果一致，并與DU等[20]報(bào)道的結(jié)果一致。

2種復(fù)合微生態(tài)制劑能夠減輕產(chǎn)氣莢膜梭菌(CP)對(duì)回腸黏膜的刺激，緩解回腸黏膜炎癥反應(yīng)，提高回腸黏膜抗氧化水平。黏蛋白是一類(lèi)由黏多糖組成的糖蛋白，主要由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生并分泌[21]。黏蛋白與水結(jié)合形成黏液，位于黏膜表面，參與構(gòu)成黏膜抵御外來(lái)病原微生物入侵的第一道屏障，具有潤(rùn)滑和保護(hù)腸道的作用。因此，黏蛋白是衡量腸道組織健康狀況的重要指標(biāo)。在黏蛋白面積率測(cè)定試驗(yàn)中，NE組的黏蛋白含量顯著高于Control組，MEA 1組和MEA 2組回腸黏蛋白的含量與NE組相比顯著降低。有研究指出枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或某些內(nèi)源性感染的條件性致病菌有明顯的抑制作用[22]。因此，本試驗(yàn)中的微生態(tài)制劑可能通過(guò)抑制CP的生長(zhǎng)繁殖，減輕了該菌對(duì)回腸黏膜的刺激，進(jìn)而緩解回腸黏膜損傷.自由基在生物體內(nèi)參與吞噬病原體、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、參與前列腺素和凝血酶原的合成等生理功能[23]?？寡趸颯OD屬于酶促自由基清除系統(tǒng)，SOD活性降低與自由基水平升高有一定的相關(guān)性[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CP感染可引起回腸腸道內(nèi)SOD和AOC活力顯著降低,表明CP感染可促進(jìn)腸道自由基的產(chǎn)生從而介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。MEA 1組和MEA 2組在感染CP后腸道內(nèi)SOD活力和AOC與Control組相比沒(méi)有顯著性差異。研究發(fā)現(xiàn)，約翰遜乳桿菌通過(guò)顯著增加T-AOC、SOD水平，對(duì)抗氧化能力表現(xiàn)出積極的影響[25]，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明在日糧中添加微生態(tài)制劑可能通過(guò)提高肉雞的抗氧化能力而緩解因CP感染所造成的氧化應(yīng)激，減輕回腸黏膜的炎癥反應(yīng)。分泌型sIgA是機(jī)體特異性免疫的重要組成之一，參與局部黏膜免疫。適當(dāng)水平的sIgA可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)，不引起免疫細(xì)胞的過(guò)度分化與增殖[26-27]。研究表明，感染CP可以上調(diào)IL-4等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[28]，提高家禽腸道炎癥免疫反應(yīng)水平[29]；下調(diào)感染細(xì)胞中的炎性細(xì)胞因子IL-6的mRNA表達(dá)[30]，證明了益生菌能抑制CP引起的炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)中，NE組sIgA水平顯著高于Control組，而MEA 1組和MEA 2組顯著緩解了這一現(xiàn)象，造成這種結(jié)果可能與回腸黏膜炎癥反應(yīng)減輕有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。