1株朱鹮源致病性擬肺炎克雷伯菌的分離鑒定與分子特征分析

翟祎夢，邱國強(qiáng)，雷 蕾，胡依凡，白洪青，秦勇強(qiáng)，翟瑞東，周瑩珊，王曉杜，楊永春*，宋厚輝*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.德清縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 德清 313200；3.湖州市生態(tài)林業(yè)保護(hù)研究中心，浙江 湖州 313099)

朱鹮(Nipponianippon)屬鳥綱(Aves)、鵜形目(Pelecaniformes)、鹮科(Threskiornithidae)、朱鹮屬(Nipponia)，被譽(yù)為“東方寶石”和“鳥中大熊貓”，國家一級保護(hù)動物[1]，曾瀕臨滅絕。疫病一直是威脅朱鹮保護(hù)的重要阻礙，目前已報道的朱鹮細(xì)菌性疾病有大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌[2-3]，未見擬肺炎克雷伯菌感染報道。

擬肺炎克雷伯菌(Klebsiellaquasipneumoniae)與肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、天花克雷伯菌(Klebsiellavariicola)，廣義都可稱為肺炎克雷伯菌[4]，是一類革蘭陰性、兼性厭氧、不動桿菌，廣泛存在于自然界以及人和動物的呼吸道、消化道、泌尿道等部位[5-7]，為重要機(jī)會致病菌[8]，可引起人和動物的肺炎、腦膜炎、腹膜炎、膀胱炎、敗血癥等多種疾病，引起世界范圍內(nèi)水禽感染，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。狹義地講，上述3種細(xì)菌為不同的種，但由于相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，擬肺炎克雷伯菌和天花克雷伯菌常被錯誤的鑒定為肺炎克雷伯菌。致病性耐藥肺炎克雷伯菌早已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，為動物常見病原菌，已有海獅[10]、狐猴[11]、水貂[12]等多種野生動物感染相關(guān)報道，而擬肺炎克雷伯菌、天花克雷伯菌在此方面的報道較少。近年來，陸續(xù)有擬肺炎克雷伯菌、天花克雷伯菌高毒力耐藥菌株報道，且部分菌株的毒力高于肺炎克雷伯菌[13-15]，因此，擬肺炎克雷伯菌、天花克雷伯菌也開始受到關(guān)注。

本研究通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化特征、16S rDNA和全基因組測序，從2020年9月浙江省德清縣下渚湖1只死亡朱鹮體內(nèi)分離鑒定到1株擬肺炎克雷伯菌，采用1日齡麻鴨致死試驗鑒定了其致病性、藥敏試鑒定了其耐藥表型，利用全基因組序列分析明確了其耐藥基因、毒力基因、ST型和分子血清型。此為首次報道擬肺炎克雷伯菌感染朱鹮，并對分離菌株的致病性、耐藥性及分子特性進(jìn)行了描述，為朱鹮擬肺炎克雷伯菌感染的防治提供了相關(guān)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例來源2020年9月，浙江省德清縣下渚湖發(fā)現(xiàn)1只瀕死成年朱鹮，經(jīng)緊急救護(hù)無效死亡。

1.2 主要試劑無菌脫纖綿羊血購自上海儒安生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基、瓊脂粉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；BHI肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭陰性菌(GN)生化鑒定卡購自Bio Mérieux公司；26種抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染色液購自杭州微生物試劑有限公司；DNeasy Power Soil Kit基因組提取試劑盒購自QIAGEN公司；KOD one DNA聚合酶購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。

1.3 病理學(xué)觀察按照先外后內(nèi)，先室后腔的原則剖檢并檢查死亡朱鹮，將采集的氣管、肺、肝等樣本固定在4%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，HE染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)及菌種鑒定

1.4.1分離培養(yǎng)和生長特性 采集的肺、肝臟和腹水等樣本在綿羊血瓊脂平板、LB瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板和Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂平板上劃線，分別放置于需氧、厭氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)18～24 h，取單菌落純化后進(jìn)行革蘭染色觀察菌體形態(tài)并測定體外生長曲線。

1.4.2細(xì)菌生化鑒定 使用Bio Mérieux公司的VITEK?2 COMPACT全自動微生物生化鑒定儀和VITEK?2 COMPACT革蘭陰性菌(GN)生化鑒定卡對分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.4.316S rDNA序列分析 挑取上述純化后的單菌落接種到BHI肉湯培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，用QIAGEN公司的DNeasy Power Soil試劑盒提取基因組。取提取的基因組2 μL為模板，引物使用16S rDNA通用引物27F和1492R，反應(yīng)體系及程序參考文獻(xiàn)[16]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，若出現(xiàn)約1 500 bp的特異性擴(kuò)增條帶，則為陽性。陽性產(chǎn)物送至杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。序列在NCBI上進(jìn)行Blast，確定細(xì)菌種類。

1.5 致病性鑒定鑒于朱鹮為珍稀瀕危野生保護(hù)動物，故選擇同為水禽的麻鴨做為實驗動物進(jìn)行感染試驗。將上述分離鑒定菌株接種于BHI肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，用PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整D600 nm值至對應(yīng)細(xì)菌數(shù)量為1×109CFU，并采用平板菌落計數(shù)法計算細(xì)菌數(shù)量[17]。將45只1日齡麻鴨平均分為5組：4組為試驗組，分別腹腔注射1×108,1×107,1×106和1×105CFU(0.2 mL/只)菌液；1組做對照組，腹腔注射無菌PBS緩沖液(0.2 mL/只)。每12 h觀察1次，連續(xù)觀察10 d[17]，死亡鴨及時剖檢觀察病理變化并分離鑒定細(xì)菌。

1.6 細(xì)菌藥敏表型鑒定選取頭孢噻肟、美羅培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星、慶大霉素等26種藥物(表1)依據(jù)CLSI-M100(2020)的操作規(guī)程[18]，運用K-B紙片法測定細(xì)菌對各種藥物的敏感性。

1.7 細(xì)菌全基因組分析

1.7.1細(xì)菌分離株全基因組測序 將1.4.3提取的基因組用Illumina Hiseq測序平臺進(jìn)行雙端150 bp測序，對獲得的測序片段進(jìn)行Clean Data處理后，應(yīng)用基于SPAdes[19]的Unicycler進(jìn)行拼接，使用GapCloser(版本：1.12)軟件對組裝結(jié)果進(jìn)行內(nèi)洞修補(bǔ)，去除冗余的段序列得到最后組裝結(jié)果。

1.7.2耐藥基因與毒力基因分析 將拼接的細(xì)菌全基因組分別于CARD(the Comprehensive Antibiotic Research Database)數(shù)據(jù)庫 (http://arpcard.mcmaster.ca)和VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。

1.7.3細(xì)菌分型 根據(jù)1.7.2鑒定的莢膜基因與菌體抗原序號確定分離株分子血清型，并利用CGE(Center for Genomic Epidemiology)網(wǎng)站(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)，對分離株進(jìn)行多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析，明確其序列號(sequence type，ST)。

1.7.4比較基因組學(xué)分析 分別采用ANI calculator(http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/index)和BRIG軟件[20]分析分離株ZH200912與肺炎克雷伯菌、擬肺炎克雷伯菌全基因組的ANI值和親緣關(guān)系圖，依此判定分離株的種類及其與菌株的親緣關(guān)系。當(dāng)兩個基因組的ANI值在95%以上時認(rèn)為是同一個種[21]，遺傳關(guān)系圖可呈現(xiàn)菌株間的同源性情況。

2 結(jié)果

2.1 病理變化剖檢可見死亡朱鹮腹腔積液，氣管內(nèi)大量血凝塊(圖1A1)，肺腫脹、淤血、切面有泡沫樣液體流出(圖1B1)，肝淤血(圖1C1)；未見寄生蟲。組織病理切片結(jié)果可見氣管黏膜上皮細(xì)胞部分壞死脫落，纖毛部分脫落，黏膜下層水腫(圖1A2，A3)；支氣管內(nèi)有脫落的上皮細(xì)胞，呼吸毛細(xì)管中有纖維素和漿液性滲出物，并有炎性細(xì)胞浸潤，部分呼吸毛細(xì)管壞死(圖1B2，B3)；肝臟中央靜脈擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞，竇周隙淤積大量紅細(xì)胞(圖1C2，C3)。

A.氣管；B.肺臟；C.肝臟

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)和菌種鑒定腹水和肺臟等樣本，在血瓊脂平板上形成白色、邊緣整齊、光滑、濕潤、粘稠、不溶血的菌落(圖2A)。在LB瓊脂上生長形成白色、圓形突起、表面濕滑的菌落(圖2B)。在伊紅美蘭瓊脂上形成中心黑色外周灰白色的菌落(圖2C)。Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂上可見白色菌落(圖2D)。分離株革蘭染色陰性，呈單株或成對排列，無鞭毛，有莢膜(圖2E)，其生長曲線見圖2F。腹水等樣本細(xì)菌分離株生化鑒定結(jié)果相同，符合肺炎克雷伯菌生化反應(yīng)。對腹水細(xì)菌分離株的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增后得到的1 500 bp特異性條帶進(jìn)行測序，在NCBI上Blast比對后，與肺炎克雷伯菌16S rDNA同源性最高，為99.86%，與擬肺炎克雷伯菌16S rDNA的同源性為99.79%，將該分離株暫定名為ZH200912，并進(jìn)一步分析鑒定。

A.血瓊脂平板；B.LB瓊脂平板；C.伊紅美藍(lán)瓊脂平板；D.Wilkins-Chalgren厭氧菌瓊脂平板；E.革蘭染色；F.菌株ZH200912的體外生長曲線；G.菌株ZH200912對1日齡麻鴨的LD50

2.3 致病性分析分離株ZH200912接種量為1×108和1×107CFU的試驗組麻鴨在7 d內(nèi)全部死亡，LD50為1×106.5CFU(圖2G)。剖檢可見，病死鴨肺臟淤血，肝腫大，與死亡朱鹮病變相似。同時，鴨內(nèi)臟細(xì)菌分離株形態(tài)、16S rDNA序列均與ZH200912相同，結(jié)果表明，該菌株對禽類具有潛在致病性。

2.4 分離株耐藥表型藥敏試驗結(jié)果顯示該菌株對氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟和磷霉素耐藥，對頭孢曲松、妥布霉素等22種藥物敏感(表1)。

表1 分離株ZH200912藥敏試驗結(jié)果

2.5 細(xì)菌基因組測序分析

2.5.1基因組組裝結(jié)果 共生成11 206 958個raw reads，裝配后基因組全長5 446 640 bp，43個contigs長度 ≥1 000 bp(N50，2 996 850)，GC含量為57.66%。

2.5.2比較基因組學(xué)分析 ANI比對分析結(jié)果顯示，菌株ZH200912對擬肺炎克雷伯菌ATCC 700603(NZ_CP014696.2)的ANI值(99.30%)高于對肺炎克雷伯菌str.Kp52.145(FO834906)的ANI值(93.29%)； BRIG軟件[20]比較結(jié)果(圖3)表明，菌株ZH200912與擬肺炎克雷伯菌的同源性更高。綜合2種比較基因組學(xué)分析結(jié)果，菌株ZH200912判定為擬肺炎克雷伯菌。

圖3 菌株ZH200912與肺炎克雷伯菌str.Kp52.145 (FO834906)和擬肺炎克雷伯菌ATCC 700603 (NZ_CP014696.2)的基因組比較分析

2.5.3毒力基因分析 通過分析該菌的基因組序列，在菌株ZH200912中發(fā)現(xiàn)了67個毒力相關(guān)基因，其中核心毒力基因18個，包括Ⅰ型和Ⅲ型菌毛蛋白基因fimACD與mrkD、鐵攝取相關(guān)基因腸桿菌素操縱子entABCEFS和fepABC基因以及鐵運輸操縱子iroEN等，外膜蛋白基因ompAC、莢膜(capsule，CPS)基因wzi398，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)基因waaF。

2.5.4分子血清型與ST型 根據(jù)2.5.3鑒定的莢膜基因與菌體抗原序號確定分離株分子血清型為K165:O12。利用CGE網(wǎng)站對擬肺炎克雷伯菌ZH200912進(jìn)行MLST分析，結(jié)果顯示，菌株ZH200912的ST分型為ST3244。

2.5.5耐藥基因分析 結(jié)果顯示該菌含有24個耐藥相關(guān)基因，主要是多藥外排泵基因acrBD、mdfA、mdtBC、emrBR，調(diào)節(jié)耐藥基因轉(zhuǎn)錄的因子marAR、CRP、baeRS，以及β-內(nèi)酰胺酶基因blaOKP-B-1，喹諾酮類藥物耐藥基因oqxAB和磷霉素耐藥基因fosA6。

3 討論

朱鹮為國家一級保護(hù)動物，在保護(hù)生物多樣性和生態(tài)文明建設(shè)中具有重要意義，但是很多疫病嚴(yán)重威脅人工繁育和野外朱鹮種群的健康，給朱鹮保護(hù)工作帶來困難。目前已有關(guān)于朱鹮感染新城疫病毒[1]、鸚鵡熱衣原體、朱鹮衣原體[22]和放線菌[23]等微生物及寄生蟲[24]的報道。本研究首次在野外死亡朱鹮體內(nèi)分離到擬肺炎克雷伯菌，初步判定為擬肺炎克雷伯菌感染導(dǎo)致死亡，提示擬肺炎克雷伯菌為朱鹮潛在病原菌。

肺炎克雷伯菌為人和動物機(jī)會致病菌，可感染人和動物，導(dǎo)致疾病的報道較多[11,25]，目前雖然也有擬肺炎克雷伯菌感染人后引起肝膿腫的報道[13]，但鮮有水禽感染擬肺炎克雷伯菌的報道。本研究病理檢查見死亡朱鹮腹腔積液，肝、肺等器官呈現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)以及不同程度的腫脹、淤血、出血、壞死，這與已報道肺炎克雷伯菌能夠引起多器官炎癥和敗血癥等病理變化相似。麻鴨致死試驗顯示，朱鹮擬肺炎克雷伯菌分離株ZH200912攻毒1日齡麻鴨的LD50為1×106.5CFU，攻毒死亡鴨病變與病死朱鹮相似，細(xì)菌分離鑒定回收到分離株ZH200912，這充分表明分離株ZH200912對水禽具有一定毒力。目前研究表明，肺炎克雷伯菌重要毒力因子主要為鐵載體、菌毛、莢膜、脂多糖等，其中，鐵攝取對細(xì)菌毒力至關(guān)重要，相關(guān)毒力因子往往與高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKp)有關(guān)，ent、fep、iro基因?qū)Υ龠M(jìn)細(xì)菌生長和提高其在特定條件的競爭優(yōu)勢具有重要作用，iro系統(tǒng)相關(guān)基因缺失會導(dǎo)致毒力減弱[26]；高黏表型相關(guān)基因rmpA和rpmA2也是高致病性肺炎克雷伯菌必不可少的。本研究分離株ZH200912攜帶67個毒力基因，包括莢膜(K165型)、Ⅰ型和Ⅲ型菌毛、脂多糖(O12)毒力基因以及鐵攝取相關(guān)腸桿菌素操縱子entABCEFS、fepABC和鐵運輸操縱子iroEN等，但是，缺失高黏表型相關(guān)rmpA和rpmA2基因。本研究分離鑒定的致朱鹮死亡的耐藥擬肺炎克雷伯的毒力因子，與FARZANA等[27]報道的1株致新生兒極高病死率的高毒力多重耐藥天花克雷伯菌類似，都只具有鐵攝取系統(tǒng)、菌毛等典型毒力因子，均缺乏rmpA/rmpA2基因。這說明擬肺炎克雷伯菌和天花克雷伯菌可能有不同于肺炎克雷伯菌的毒力因子，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

近年來，擬肺炎克雷伯菌的多重耐藥情況也日益受到關(guān)注，攜帶blaKPC-2、blaOKP-B-6，aph(3’)-VIa，銀抗性基因的多重耐藥人源擬肺炎克雷伯菌[28]、攜帶mcr-8.2的豬源擬肺炎克雷伯菌以及人源耐碳青霉烯擬肺炎克雷伯菌[15]均有報道。本研究分離鑒定的擬肺炎克雷伯菌分離株ZH200912盡管對多種藥物敏感，但也呈現(xiàn)出四重耐藥表型：攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因blaOKP-B-1和磷霉素耐藥基因fosA6與其對青霉素類藥物和磷霉素耐藥表型一致；攜帶外排泵基因acrBD、mdfA、mdtBC、emrBR及耐藥基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子marAR、CRP、baeRS可能與頭孢噻肟耐藥有關(guān)；攜帶喹諾酮類耐藥基因oqxAB但無耐藥表型，提示該菌可能是一個多藥耐藥基因的儲存庫[4]。由于擬肺炎克雷伯菌可以融合其他基因以適應(yīng)環(huán)境，可通過增加耐藥基因和毒力因子來提高耐藥性和致病力[29]，因此后期仍需持續(xù)監(jiān)測朱鹮及其環(huán)境中的擬肺炎克雷伯菌。

擬肺炎克雷伯菌與肺炎克雷伯菌具有非常相似的生化和表型特征，在傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定中常被錯誤的歸類為肺炎克雷伯菌[30]，從而忽視其在引起動物感染方面的重要性。本研究前期通過細(xì)菌分離、生化及16S rDNA序列鑒定，將分離株ZH200912鑒定為肺炎克雷伯菌，但全基因組序列分析確定該菌株為擬肺炎克雷伯菌。因此，在鑒別菌種時，應(yīng)配合使用管家基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性[31]。截至目前，在獸醫(yī)臨床上關(guān)于擬肺炎克雷伯菌的報道較少，對其研究主要是基于肺炎克雷伯菌數(shù)據(jù)。我們認(rèn)為擬肺炎克雷伯菌是一種被忽視的動物病原體，本研究關(guān)于朱鹮源多重耐藥致病性擬肺炎克雷伯菌的發(fā)現(xiàn)及其特征描述，為該類條件致病菌的監(jiān)測和控制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，特別是野生水生動物中流行應(yīng)該引起關(guān)注，提示應(yīng)重視擬肺炎克雷伯菌對動物的潛在危害并加強(qiáng)對其毒力因子的研究。