牛源多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌雙重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

高 瑞，謝玉杰，繆西鵬，姜興佳，牛耀祖，許立華*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏威科嘉動(dòng)物科技有限公司，寧夏 銀川 750004)

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory diseases complex，BRDC)在國內(nèi)外頻繁報(bào)道，多呈散發(fā)性或地方流行性[1]。BRDC又稱“運(yùn)輸熱”(shipping fever)，是由病毒或細(xì)菌單純感染或混合感染引起的一大類疾病的總稱。牛感染了BRDC，會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒、呼吸急促、反復(fù)咳嗽、鼻和/或眼睛有分泌物、腹瀉、脫水和食欲不振，對牛的健康和生產(chǎn)性能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[2]。多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)是牛呼吸道疾病的重要致病菌[3-4]。Pm和Mh均為革蘭陰性條件性致病菌，是健康反芻動(dòng)物上呼吸道和扁桃體隱窩的正常共生體。然而，在動(dòng)物防御機(jī)制下降和受到應(yīng)激時(shí)，它可以遷移到肺部，引起急性纖維素性胸膜肺炎。牛多殺性巴氏桿菌病主要包括由莢膜血清A型引起的肺炎和莢膜血清B型引起的出血性敗血癥(hemorrhagic septicemia，HS)，后者一旦出現(xiàn)發(fā)病跡象，很快死亡，病死率接近100%[5]。在國外，Mh主要流行生物型A血清1和6型[6]，而我國，Mh生物型A血清1型在牛肺炎中占主導(dǎo)地位，而血清2型在綿羊和山羊病中占主要優(yōu)勢[7]。

開展準(zhǔn)確、快速的病原檢測是牛呼吸道疾病綜合防控措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Pm和Mh均屬于巴斯德菌科，引起的臨床癥狀較為相似，且多以混合感染及繼發(fā)感染等形式出現(xiàn)，傳統(tǒng)的病原分離、培養(yǎng)及鑒定方法耗時(shí)費(fèi)力，為準(zhǔn)確診斷帶來困難。本研究建立了一次反應(yīng)可同時(shí)檢測Pm、Mh 2種牛源細(xì)菌性病原的雙重PCR方法，為快速檢測牛呼吸道傳染病及開展流行病學(xué)調(diào)查提供有利的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株及臨床樣本Pm(CVCC447)、Mh(CVCC4086)、綠膿桿菌(CVCC3359)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、致病性大腸桿菌(ATCC35150)、肺炎克雷伯菌(ATCC13883)、鼠傷寒沙門菌(ATCC14028)、無乳鏈球菌(ATCC13813)、停乳鏈球菌(ATCC12388)購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫；牛支原體菌株、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)毒株、牛病毒性腹瀉-黏膜病毒(BVDV)毒株、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。

2021年3-11月間，從寧夏地區(qū)各規(guī)?；霾杉伤坪粑腊Y狀病牛的118份樣品，包括鼻拭子、乳樣及臟器等。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基口腔拭子基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq 預(yù)混試劑Ⅱ、DL2000 DNA Marker 均購自天根生化科技(北京)有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；營養(yǎng)瓊脂(NA)、腦心浸出液肉湯(BHI)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；支原體培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室配制；脫纖維羊血購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù) GenBank收錄的PmKmt1基因、MhLkt基因，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對特異性引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 雙重PCR引物序列

1.4 菌株、毒株及病料DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA；采用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA/RNA。臨床拭子用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA、總RNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Pm和Mh雙重PCR檢測方法的建立

1.5.1雙重PCR反應(yīng)條件的設(shè)立及優(yōu)化 將提取的細(xì)菌基因組DNA通過紫外分光光度計(jì)測量濃度，用公式[copies/μL=(6.02×1023)×(mg/L×10-9)/(DNA長度×660)]計(jì)算其拷貝數(shù)濃度。將兩者等體積混勻作為雙重PCR的模板，建立25 μL反應(yīng)體系，分別對退火溫度(50～65℃)、引物濃度(0.05～0.4 μmol/L)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系：2種病原菌基因組DNA各1 μL，2對上、下游引物各1 μL，2×Taq 預(yù)混試劑Ⅱ12.5 μL，ddH2O 9 μL，總體系為25 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，50～65℃ 30 s，72℃ 1 min， 共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，篩選出最佳溫度和引物濃度。

1.5.2Pm和Mh雙重PCR檢測方法特異性試驗(yàn) 利用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，以Pm、Mh、牛支原體、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、IBRV基因組DNA、BVDV及BRSV總cDNA為模板，同時(shí)加入1.5.1中最優(yōu)引物濃度2對、2×Taq 預(yù)混試劑Ⅱ、ddH2O，按1.5.1中最佳退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，評估該雙重PCR方法的特異性。

1.5.3Pm和Mh雙重PCR檢測方法靈敏性試驗(yàn) 將Pm和Mh基因組 DNA 10倍倍比稀釋，通過1.5.1中摸索的最佳條件，以各個(gè)稀釋度的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測本方法的靈敏度。設(shè)置陰性對照(滅菌 ddH2O)，評估該方法的敏感性。

1.5.4Pm和Mh雙重PCR檢測方法重復(fù)性試驗(yàn) 以1.5.3中最低檢測限的基因組DNA稀釋倍數(shù)濃度為模板，以1.5.1中建立的雙重PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增，并且在隨后的2周內(nèi)重復(fù)3次，以檢測該方法的重復(fù)性。

1.6 Pm和Mh雙重PCR檢測方法的臨床應(yīng)用將處理后的118份樣品，其中拭子83份(鼻拭子80份，咽拭子2份，環(huán)境拭子1份)，乳樣16份，臟器組織18份(腸管6份，肺臟5份，脾臟3份，肝臟2份，心臟、腎臟各1份)，淋巴1份。用試劑盒提取核酸，利用建立的雙重PCR檢測方法與單重PCR分別進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該多重PCR方法的可靠性，單一PCR方法參照TOWNSEND等[8]建立的Pm特異性PCR方法，ALEXANDER等[9]建立的Mh特異性PCR方法，評價(jià)臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 模板濃度的確定Pm、Mh基因組DNA的濃度分別為3.14×1011， 3.96×1011copies/μL，將兩者等體積混勻作為雙重PCR的模板(Pm、Mh基因組DNA的濃度分別為1.57×1011，1.98×1011copies/μL)，

2.2 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化及擴(kuò)增結(jié)果將多重PCR檢測方法退火溫度設(shè)定為8個(gè)梯度，分別為50，51，53，55.9，59.5，62.5，64.1，65℃。最終根據(jù)特異性及引物二聚體生成量少，選取最佳退火溫度為62.5℃(圖1)。其他條件不變，選取條帶中最清晰且各引物用量最少的濃度，最終確定反應(yīng)最佳引物濃度為0.25 μmol/L，結(jié)果如圖2所示。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.分別為退火溫度由53～65℃遞增的PCR產(chǎn)物

M.DL2000 DNA Marker；1～8.分別為引物終濃度由0.05～0.4 μmol/L遞增的PCR產(chǎn)物

2.3 雙重PCR檢測方法特異性試驗(yàn)結(jié)果利用已優(yōu)化的雙重PCR方法對Pm、Mh、牛支原體、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、綠膿桿菌、IBRV、BVDV、BRSV核酸進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對照。結(jié)果顯示，Pm和Mh混合模板擴(kuò)增出了2個(gè)條帶，大小分別為476，948 bp，而其他病原的核酸及陰性對照均未出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果如圖3所示，表明該方法具有良好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1～14.分別為Pm+Mh，Pm，Mh，支原體，金黃色葡萄球菌，致病性大腸桿菌，肺炎克雷伯菌，鼠傷寒沙門菌，無乳鏈球菌，停乳鏈球菌，綠膿桿菌，IBRV，BVDV，BRSV的PCR產(chǎn)物；15.陰性對照

2.4 雙重PCR檢測方法靈敏性試驗(yàn)結(jié)果將Pm、Mh等體積混合基因組DNA以102～108梯度稀釋后作為模板，ddH2O為陰性對照，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖4所示，Pm和Mh最低檢測限分別為1.57×105，1.98×106copies/μL，表明該方法具有較好的敏感性。

M.DL2000 DNA Marker；1～7.分別為模板濃度102～108倍稀釋濃度；8.陰性對照

2.5 雙重PCR檢測方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果通過已優(yōu)化的雙重PCR方法在不同的時(shí)間段做3次重復(fù)，每次檢測結(jié)果Pm和Mh均為陽性，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 Pm和Mh雙重檢測方法的初步臨床應(yīng)用利用本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法和單重PCR對寧夏地區(qū)采取的118份臨床樣品進(jìn)行檢測，如圖5～7所示，結(jié)果顯示雙重PCR方法對Pm、Mh的檢出率分別為57.63%(68/118),30.51%(36/118)，混合感染檢出率為24.58%(29/118)；單重PCR方法對Pm、Mh的檢出率分別為54.24%(64/118),26.27%(31/118)。2種方法的總符合率分別為Pm 91.53%，Mh 94.07%；相對敏感性分別為Pm 89.71%，Mh 83.33%；相對特異性分別為Pm 94%，Mh 98.78%；Kappa值分別為Pm 0.82，Mh為0.85，數(shù)據(jù)如表2、3所示。結(jié)果表明，本研究所建立的雙重PCR檢測方法能快速檢測出Pm、Mh 2種病原。

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3～9.為臨床樣品

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3～9.為臨床樣品

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.陰性對照；3～9.為臨床樣品

表2 雙重PCR與單重PCR方法對臨床樣本Pm的檢測結(jié)果

表3 雙重PCR與單重PCR方法對臨床樣本Mh的檢測結(jié)果

3 討論

牛呼吸道綜合征是由多種因素及病原體感染引起的系統(tǒng)性呼吸道疾病，Pm和Mh作為牛呼吸道疾病(bovine respiratory diseases，BRDs)的主要細(xì)菌性病原體[10]，在我國流行范圍廣，受到眾多學(xué)者的關(guān)注。我國自2008年首次發(fā)現(xiàn)牛感染血清A型Pm以來，Pm引起?；疾〉陌l(fā)生率在不斷上升[11-12]。本研究對臨床病例樣品中Pm檢測發(fā)現(xiàn)，鼻拭子提取的基因組DNA，通過血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，主要以莢膜血清A型Pm居多，而乳樣中主要是莢膜血清B型Pm。因此，Pm會(huì)使產(chǎn)奶量下降或急性死亡，給牧場造成巨大的損失，亟需建立一種同時(shí)檢測Pm和Mh的雙重PCR檢測技術(shù)。

目前，已經(jīng)建立了牛源Pm和牛支原體雙重PCR檢測方法[13]、羊源Mh和Pm雙重PCR檢測方法[14]、化膿隱秘桿菌和Mh雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法[15]，但未見建立牛源Pm和Mh的雙重PCR檢測方法。為了進(jìn)一步對牛源的這兩種病原進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測和診斷，本研究通過對引物篩選，保證引物的特異性，優(yōu)化了反應(yīng)溫度和最佳引物濃度，建立了牛源Pm與Mh雙重PCR檢測方法。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)也說明了該方法具有高度特異性和較高敏感性。通過對臨床樣本的檢測，結(jié)果顯示，Pm的檢出率為57.63%(68/118)，Mh的檢出率為30.51%(36/118)，混合感染檢出率為24.58%(29/118)，Pm和Mh呈現(xiàn)較高的感染率。因此，對牛源Pm和Mh所致疾病的防治不容忽視。

綜上所述，本研究所建立的可同時(shí)檢測Pm和Mh的雙重PCR檢測方法，具有高度特異性和較高敏感性，在臨床初步應(yīng)用中效果較好。該方法對快速準(zhǔn)確檢測Pm和Mh兩種病原菌、指導(dǎo)臨床用藥、提高牛呼吸道疾病的防治效果提供了可靠的技術(shù)支持。