貉源細小病毒(RDPV)HeB17株的分離鑒定及基因組序列分析

王振軍，羅國良，程悅寧，馮二凱，劉利芳，郭 利，于清平，朱先鵬，鄧旭明，王建鋒*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.中國農業(yè)科學院 特產研究所，吉林 長春 130122；3.通化縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化 134100；4.柳河縣農業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 柳河 135300)

近年，貉源細小病毒(RDPV)在我國主要貉養(yǎng)殖地區(qū)(東北三省、河北、山東)普遍流行，尤以夏季(6-7月份)仔貉分窩時最為嚴重，病貉主要表現(xiàn) 為嚴重的腹瀉、脫水、消瘦等胃腸炎癥狀，嚴重者以死亡告終[1]。該病發(fā)病及死亡率均較高，對我國貉養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失。因RDPV感染貉主要表現(xiàn)為腸炎癥狀，故稱該病為RDPV性腸炎。

RDPV性腸炎是由RDPV引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病1982年由NEUVONEN等[2]首次報道犬細小病毒(CPV)感染貉，此后國外和我國黑龍江地區(qū)也偶見相關報道[3-4]，起初普遍認為是CPV跨種傳播感染貉[5-7]，直到1988年由夏咸柱等[8]從病貉中分離出RDPV才確認RDPV在我國的流行。長期以來，國內外科研人員對RDPV性腸炎的報道及相關研究相對較少，但近年來，尤其2015年之后，RDPV性腸炎有區(qū)域性集中暴發(fā)的趨勢，對我國貉養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失，這引起了科研人員對RDPV的再次關注[9-10]。

RDPV為細小病毒科細小病毒屬成員，是單鏈DNA病毒[11]。其基因結構與細小病毒屬其他成員結構類似，與CPV、水貂細小病毒(MEV)、貓細小病毒(FPV)有較高的同源性，甚至與犬細小病毒滅活苗和水貂細小病毒滅活苗存在一定交叉保護[12]。本研究從疑似RDPV感染的貉腸道及其內容物中成功分離1株病毒，進一步對分離得到的病毒進行PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察、豬紅細胞凝集試驗、基于VP2基因建立的系統(tǒng)發(fā)生樹分析、同源性分析、動物回歸試驗等方法的鑒定并對其VP2基因組進行了克隆測序分析[13-14]，以期了解河北地區(qū)RDPV性腸炎的流行趨勢，為進一步研發(fā)RDPV性腸炎疫苗及相關診斷試劑提供資源和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料病料樣品取自河北某貉養(yǎng)殖場的發(fā)病貉，采集病貉的腸道及其內容物用于RDPV的分離、培養(yǎng)和鑒定。F81貓腎細胞購自上海細胞庫，傳代后保存于中國農業(yè)科學院特產研究所。

M.M培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清由長春西諾生物科技有限公司提供；ExTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純，購自國藥化學試劑。

10只2～12月齡的健康試驗貉，抗RDPV HI抗體效價≤1∶8，購自中國農業(yè)科學院特產研究所毛皮動物試驗基地。

1.2 病料樣品處理取腸道及內容物加入MEM充分研磨后制成10%的懸液，研磨過程中反復凍融3次，加入等體積氯仿混勻，靜置30 min。經10 000 r/min 4℃離心30 min取上清，通過0.22 μm的濾膜過濾。加入每毫升1 000 U雙抗4℃過夜，-70℃保存。

1.3 病料樣品PCR鑒定取處理的病料懸液用DNA提取試劑盒提取其基因組，根據(jù)康洪濤等[15]設計RDPV檢測引物進行PCR檢測，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 病毒分離、培養(yǎng)及形態(tài)學檢驗將處理好的病料樣品按2%的比例同步接種于生長良好的F81細胞，設立正常細胞對照，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)并逐日觀察細胞生長狀態(tài)，當80%細胞出現(xiàn)CPE時收獲接毒細胞，連續(xù)培養(yǎng)3～6代，保存在-70℃以下；取第6代病毒細胞培養(yǎng)物反復凍融數(shù)次后經4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液經0.5%磷鎢酸負染后進行電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.5 豬紅細胞凝集試驗取第1～6代病毒培養(yǎng)物進行豬紅細胞凝集試驗鑒定分離毒株的血凝特性。

1.6 病毒理化性質測定選取第6代病毒培養(yǎng)物，分別對其進行乙醚敏感性試驗、耐酸性試驗、耐熱性試驗同時設立對照組，以測定其理化性質。具體操作如下：取病毒液1.6 mL，加乙醚0.4 mL，振蕩10 min，置于2～8℃冰箱24 h。次日去除水相并使乙醚完全揮發(fā)，測定乙醚處理前和處理后病毒含量變化，判定病毒對乙醚的敏感性；取病毒液2 mL，先用酸將其pH調至3.0，在37℃作用1 h后，再用碳酸氫鈉將pH調至7.2，然后測定每毫升病毒含量的變化，判定病毒對酸的耐受性；取病毒液2 mL，56℃水浴1 h，測定每毫升病毒含量的變化，判定病毒對熱的耐受性。

1.7 病毒核酸的提取及VP2基因的擴增通過DNA提取試劑盒提取病毒DNA，根據(jù)GenBank中已登錄的RPDV序列，設計合成其VP2序列引物：RDPV-F：5′-GCCGGTGCAGGACAAGTA-3′；RDPV-R：5′-CAACCCACACCATAACAACA-3′。利用設計的引物擴增病毒的VP2序列，預計擴增產物長度為1 755 bp。

1.8 病毒VP2基因的遺傳進化分析及同源性分析將擴增得到的VP2基因進行測序后獲得病毒VP2基因序列，利用生物信息學軟件DNAStar、Mega 5.0分析分離病毒以及GenBank中登錄的其他參考株序列的同源性，構建分離病毒VP2基因及參考序列的遺傳進化樹并分析其遺傳進化關系。

1.9 動物回歸試驗選取10只健康貉并對其進行分組，試驗組5只，對照組5只。用第6代病毒細胞培養(yǎng)物對試驗貉進行人工感染試驗，接種途徑為灌服，接種劑量為5 mL(HA效價210、含5×107TCID50)，對照組接種相應體積的正常細胞培養(yǎng)物，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d，逐日對試驗貉的精神、食欲、體溫、糞便情況進行記錄，同時采集試驗貉的糞便樣品進行豬紅細胞凝集試驗檢測。

2 結果

2.1 病料樣品PCR鑒定結果病料樣品經RDPV檢測引物PCR鑒定后，結果顯示，擴增出長度近573 bp的特異性條帶，與預期的目的片段長度一致(圖1)。結果表明，該病料樣品中含有RDPV。

2.2 病毒分離、培養(yǎng)及形態(tài)學觀察結果將處理的病料按照2%的比例同步接種于生長良好的F81細胞，連續(xù)盲傳3代，傳至第3代72 h后，細胞出現(xiàn)脫落、拉網、聚集等明顯的CPE，而對照組細胞生長狀態(tài)正常，未見異常變化(圖2)。繼續(xù)傳至第6代后對其進行標記并保存在-70℃以下；對病毒進行負染后在電鏡下觀察，可見直徑約25 nm的球狀、無囊膜、無纖突的病毒樣粒子，這與細小病毒粒子的大小相符(圖3)。結果表明，分離到的病毒株為細小病毒。

A.正常F81細胞；B.病料樣品接種F81細胞后72 h出現(xiàn)的CPE

圖3 電鏡下的病毒粒子(40 000×)

2.4 豬紅細胞凝集試驗結果以第1～6代病毒的細胞培養(yǎng)物進行血凝-血凝抑制試驗，結果顯示，第1～6代病毒的血凝價分別為1∶512,1∶512,1∶1 024,1∶1 024,1∶1 024和1∶1 024(圖4)。結果表明，所分離的細小病毒具有豬紅細胞凝集特性。

1～6.第1～6代病毒的細胞培養(yǎng)物；7～8.正常細胞對照

2.5 病毒理化性質測定結果第6代毒種培養(yǎng)物經乙醚處理、酸處理和56℃高溫處理后，試驗組和對照組病毒效價無明顯差異(表3)。結果表明，分離的病毒能耐受乙醚、酸和熱處理。

表1 病毒培養(yǎng)物理化特性試驗結果 TCID50/mL

2.6 病毒分子生物學鑒定、序列分析及同源性比對結果分離株VP2基因PCR擴增結果(圖5)，顯示，在1 755 bp處有目的條帶，片段大小符合預期，進一步證實分離株為RDPV。分離株VP2序列測序后與GenBank中具有代表性的CPV、FPV、MEV以及RDPV等20余株病毒的VP2基因進行對比并建立進化樹(圖6)，結果顯示，分離株VP2基因序列與CPV-b2毒株VP2序列相似度較高，位于同一分支上，表明分離株VP2序列與CPV-b2毒株親緣關系最近；CPV-b2毒株VP2基因序列與RDPV-HLJ11-1、RDPV-LN-10-1、RDPV-HeB-10-1、Abashiri/MEV以及CU-4/FPV毒株VP2基因序列相似性均較高，位于同一分支且在這些序列的上游，表明以上參考株在遺傳關系上較近，提示RDPV、MEV、FPV均與CPV-b2有關，但是否是由CPV適應不同宿主后形成的新類型仍需更多數(shù)據(jù)的證實。

M.DL2000 Marker；1.VP2基因擴增結果

圖6 RDPV-HeB17分離株VP2基因序列進化樹

與參考毒株VP2序列進行同源性比對，結果顯示，其同源性在98.4%～99.5%之間，其中與CU-4-FPV株同源性最低為98.4%，與CPV-b-2株同源性最高為99.5%。此外，本研究中的分離株與國內參考序列對比發(fā)現(xiàn)其同源性要高于國外序列參考株，由此可推測，該分離株在我國可能有相同的起源。

2.7 動物回歸試驗結果對健康試驗貉分組后進行人工感染試驗，結果顯示，4只試驗組貉分別在攻毒后第5和6天開始出現(xiàn)精神不振、食欲減退、腹瀉、便血等嚴重的腸炎臨床癥狀，但是體溫并無顯著升高；隨著病情發(fā)展出現(xiàn)食欲廢絕、消瘦脫水、個別病情嚴重的病貉出現(xiàn)死亡；采集糞便樣品處理后進行紅細胞凝集試驗，結果顯示對豬紅細胞血凝(HA)效價均>1∶128(表2)。對死亡試驗貉剖檢可見典型的腸炎癥狀：胃表面蒼白，胃黏膜發(fā)紅,腸系膜淋巴結腫大，腸黏膜出血，腸內有血樣內容物,肝脾腫大(圖7)，對照組試驗貉無任何臨床癥狀。以上結果表明，所分離病毒可對試驗貉造成再次感染，動物回歸試驗成立。將所分離病毒株命名為RDPV-HeB17。

表2 動物回歸試驗結果(第9天)

圖7 攻毒后照片(糞便、臟器病變)

3 討論

RDPV自20世紀80年代分離鑒定以來一直鮮有報道。但隨著我國貉養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，地區(qū)間頻繁引種以及貉養(yǎng)殖環(huán)境治理欠佳，RDPV近年時有暴發(fā)，多位科研人員對該病均有報道，使貉養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴重的經濟損失。針對RDPV，目前尚無有效疫苗產品問世，加強RDPV流行病學及致病機制的研究及其疫苗的研發(fā)投入對RDPV的防控至關重要。

本研究對所分離RDPV進行PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察、豬紅細胞凝集試驗、基于其VP2基因建立系統(tǒng)發(fā)生樹、同源性分析，并以CPV、FPV、MEV以及RDPV進行參考，結果顯示所分離RDPV-HeB17與RDPV-HLJ、RDPV-LN親緣關系較近，調查這些毒株的來源可知，這些毒株的地緣關系也非常近(分別位于河北、黑龍江、遼寧)，根據(jù)對以上地區(qū)貉養(yǎng)殖場的走訪得知，這些地區(qū)之間存在頻繁的引種，這或許對該病的流行起到了促進作用。進化分析還顯示該分離株與CPV、貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)、水貂腸炎病毒(MEV)也處于同一分支，且CPV處于分支的上游，說明CPV、FPV、MEV、RDPV這些肉食獸細小病毒親緣關系較近，這也再次驗證了RDPV極有可能是由CPV變異而來，但使用CPV疫苗免疫貉又不能使貉獲得完全保護，也證實了通過長時間的自然選擇和環(huán)境壓力，已經逐漸形成了一個新的適應在貉體內增長繁殖的細小病毒。

分離株VP2基因與參考毒株VP2基因序列同源性比對結果顯示，與CU-4-FPV株同源性最低為98.4%，與CPV-b-2株同源性最高為99.5%。氨基酸對比結果顯示，分離株VP2蛋白序列與RDPV-HeB10-1、RDPV-LN10-1、RDPV-HLJ11-1相比有3處突變，第27位氨基酸殘基由絲氨酸(S)突變?yōu)樘K氨酸(T)，第297位氨基酸殘基由絲氨酸(S)突變?yōu)楸彼?A)，第562位氨基酸殘基由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L)。有報道表明第562位氨基酸突變對RDPV宿主范圍有一定程度影響[10]，但第27位、第297位氨基酸突變對病毒的影響還不清楚，有待進一步研究。

本研究從發(fā)病貉腸道及內容物中成功分離到1株病毒，并對其進行了一系列鑒定，證實該分離株為RDPV，命名為RDPV-HeB17。該毒株的分離對RDPV的進一步研究奠定了基礎，也為其疫苗的研制提供了材料。